申严

慢性肺源性心脏病(COPD)是严重威胁人类健康的常见疾病，其住院病死率长期以来居高不下［1－3］。既往大多以低氧高压等方法直接制备动物COPD模型，其实质更大程度上是肺动脉高压模型，而临床上80%以上的肺心病均是由COPD所引起［4－6］，因此本研究拟在形成犬COPD模型后进一步建立肺心病模型，使之更贴近临床实际，并在此基础上了解犬肺静脉组织中P样细胞的表达，以期为日后研究肺心病患者易并发房颤的机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 采用健康雄性犬10只，体重(18±0.6)kg，年龄1～2岁，均严格按实验用动物标准规范化饲养。随机分为实验组与对照组，每组5只，其中实验组犬采用脂多糖(LPS)法制作COPD模型，对照组犬不采用任何处理。

1.2 方法

1.2.1 实验组犬采用每日熏5%大前门牌香烟0.5 h和2次气管内注入脂多糖各200 μg制作慢性阻塞性肺疾病模型，其后以低氧高二氧化碳仓制备肺源性心脏病模型，取肺静脉组织行连续切片后进行HE法染色。

1.2.2 肺功能测定:实验组犬末日熏香烟后，与对照组一起用1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定于操作台，气管切开插入Y型气管插管。Y型气管插管两端分别与流速、压力传感器连接，流速传感器对应端与动物呼吸器相连接。设置潮气量10 ml/kg，呼吸频率60次/min。将压力、流速传感器分别与Maclab数据记录分析系统连接。外加25 cm H2O的压力，迫使动物深吸气，再以25 cm H2O的负压吸引，造成深呼气，较准确测出峰值呼气流速(PEF)和0.3 s呼气最大流速(FEV 0.3)。

1.2.3 肺动脉及右心室压力测定［7］:用 10% 乌拉坦(1 ml/100 g)腹腔麻醉，分离大鼠右侧颈外静脉，将塑料导管(外径=1 mm，内径016 mm)，一端连接压力传导器，一端从颈外静脉插入，用POLYGRAPH SYSTEM生理记录仪观察压力波形，以辨别导管顶端在右心室及肺动脉位置，测定并记录平均肺动脉压力(Pap)和平均右心室压力(Rvp)，测试完毕由颈内静脉取血样本。立即剪开大鼠胸腔，取出心脏，剪去心房组织，沿心室间隔边缘剪下右心室，分别称量右心室和左心室加室间隔的重量，以右心室/(左心室+室间隔)［R/(L+S)］的重量比和右心室/体重(R/BW)，来反映右心室重量的变化，确定右心室有无肥厚。

1.2.4 γ-GCS活性的测量按照试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书进行，分光光度计分别测量412 nm及532 nm处吸光度值变化。采用免疫组化和原位杂交方法检测肺组织中γ-CCS及γ-CCS mRNA表达和p-PKB蛋白表达。

1.2.5 肺静脉切片［8］:分离其肺静脉。垂直肺静脉长轴切成2 mm宽度的连续环形组织块，以碳素墨汁作为边缘标记。其中1、3、5等单编号的组织块用10%中性福马林固定24 h后制成蜡块，作肺静脉环状连续切片，行HE染色，×400光学显微镜观察。

1.3 统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组肺动脉压、右心室压及右心室比较 实验组犬右心室明显肥厚，右心室游离壁重增加。光镜检查肥厚心肌细胞有不同程度增大，但以细胞数量增多为主，细胞核变大。实验组犬肺动脉压力与对照组相比明显增高(P＜0.05)。见表1。

表1 2组犬肺动脉压、右心室压及右心重量的变化n=5，

表1 2组犬肺动脉压、右心室压及右心重量的变化n=5，

R/BW实验组组别 Pap(mm Hg)Rvp(mm Hg) R/(L+S)41 ±7 39.2 ±5.6 0.69 ±0.12 0.78 ±0.11对照组 25 ±5 19.2 ±2.7 0.22 ±0.03 0.48 ±0.11 t值＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.056.229 9.218 8.356 11.158 P值

2.2 电镜观察 观察到形态与窦房结P细胞相似的苍白细胞，单个或成群出现，细胞呈圆形、椭圆形，细胞浆染色浅。细胞核呈圆形或椭圆形位于细胞中央，染色质和核仁不明显。苍白细胞大多分布在靠近肺静脉内膜侧的肌袖组织中。

2.3 2组肺内γ-GCS活性、γ-GCS mRNA表达 2组γ-GCS活性比较，差异具有统计学意义(P ＜0.05)。2组γ-GCSmRNA OD值比较，差异也具有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 2组犬肺内γ-GCS活性、γ-GCS mRNA表达n=5，

表2 2组犬肺内γ-GCS活性、γ-GCS mRNA表达n=5，

组别 γ-GCS活性(U) γ-GCSmRNA(OD值)3.19 ±0.52 0.44 ±0.06对照组 2.25 ±0.42 0.31 ±0.05 t值实验组＜0.05 ＜0.055.302 6.009 P值

2.4 2组肺内γ-GCS和p-PKB蛋白表达(OD值) 实验组与对照组γ-GCS中IH、蛋白质印迹比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。实验组与对照组p-PKB中IH、蛋白质印迹比较，差异也均有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

2.5 p-PKB蛋白表达与γ-GCS活性、mRNA、蛋白表达相关性p-PKB蛋白表达与γ-GCS活性、mRNA、蛋白表达均为正相关(P ＜0.05)。见表4。

表3 2组犬肺内γ-GCS和p-PKB蛋白表达(OD值)n=5，

表3 2组犬肺内γ-GCS和p-PKB蛋白表达(OD值)n=5，

组别 γ蛋白质印迹实验组 0.357 ±0.045 0.217 ±0.040 0.326 ±0.038 0.198 ±-GCS IH 蛋白质印迹p-PKB IH 0.030对照组 0.241 ±0.039 0.125 ±0.031 0.219 ±0.035 0.071 ±0.012 t值6.589 7.368 6.275 13.738 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表4 p-PKB蛋白表达与γ-GCS活性、mRNA、蛋白表达相关系数(r值)

3 讨论

本研究模拟人类慢性阻塞性肺疾病的发生、发展过程，采用每日熏香烟和两次气管内注入脂多糖(LPS)法，继而低氧高二氧化碳仓制作犬肺源性心脏病模型，结果此制备成功，模型符合犬肺源性心脏病的病生理学和形态学标准。我们在实验中发现，COPD大鼠模型中γ-GCS活性、mRNA和蛋白表达水平均增高，同时在免疫组化和western印迹检测中发现p-PKB表达水平也相应增高，并且表达强度与γ-GCS活性、mRNA和蛋白表达呈正相关，从而提示p-PKB对γ-GCS表达有调控作用，而γ-GCS作为谷胱甘肽限速酶在慢性阻塞性肺疾病的氧化/抗氧化失衡发病机制中起重要作用。本研究结果显示:(1)犬终末细支气管管壁增厚，管腔狭窄，肺泡壁变薄及肺泡孔扩大，右室游离壁组织体积及重量均明显增加;(2)肺静脉组织中可见散在分布的P样细胞。因此，通过先烟熏、脂多糖法，继而低氧高二氧化碳仓可成功制备犬肺源性心脏病模型;犬肺静脉组织中存在P样细胞。

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