刘星，邱慧珍＊，张文明，李亚娟，滕桂香，贾欢欢

（1.甘肃农业大学资源与环境学院，甘肃 兰州730070；2.甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州730070）

我国的烟叶种植面积和产量均居世界首位，烟叶生产在我国国民经济中占有重要地位，已连续十余年成为全国第一利税大户［1－3］。地处陇东黄土高原的甘肃省正宁县烟区，属于优质烤烟（Nicotianatabacum）种植的适宜区，烤烟栽培历史悠久，烤烟生产已成为当地富民强县的支柱和特色产业。然而，近年来由于长期连作和大量施用化肥，忽略了有机肥的施用，造成烟叶产量和品质持续下降，尤其是烟叶内在品质下降，油份减少、香气不足，导致种植效益下降［4，5］。因此，如何通过营养调控改善其品质，提高烟叶致香物质含量和香气质量是该县烤烟种植中急需解决的问题。

烟叶的香气量和香味是影响烟叶品质和商品价值的主要因素之一，与烟叶中致香物质含量密切相关［6］。研究表明，影响烤烟致香物质含量的因素包括施肥、土壤条件、光照、温度、水分、干旱胁迫、成熟度、采收及海拔等［6，7］，其中施肥尤其是施用有机肥是提高烟叶香气物质含量的最主要和最有效的措施之一［3，7］。目前，农田生态系统中有机肥施用正作为一种环境友好型作物生产技术越来越受到重视［8］。烟田常用的有机肥有饼肥、堆肥和厩肥等，其中以饼肥最为普遍。有关饼肥在烤烟上的施用效果国内已有大量的研究，施用适量饼肥可以提高烤烟的产量和产值［9，10］，提高土壤的生物活性［11］，改善烟叶品质［12，13］，增加香气物质［14］。微生物有机肥是近年来推广的一种新型肥料，它集有机肥和化肥的优点为一体，并含有多种有益拮抗微生物，有缓解作物连作障碍的功效。增施微生物有机肥能够显著提高土壤供应养分的能力，激发土壤中氮素、磷素的释放，增加烤烟烟叶中的钾含量，降低烟碱含量，减少氯含量［15］。目前，关于微生物有机肥在烤烟上的相关报道多集中在土壤理化性状、养分供应能力、生理代谢、叶片常规化学品质上，而对最能表现烤烟商品特性的香气性质、含量、组成比例等方面却鲜有报道，为此，本研究通过大田试验探讨微生物有机肥对陇东烤烟致香物质含量的影响及其可能的机理，以期为当地烤烟种植中有机肥的施用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

大田试验于2009年在甘肃省庆阳地区正宁县进行。正宁县地处黄土高原沟壑区，属大陆性季风气候，为优质烤烟种植的适宜区。全县烤烟主产区乡镇海拔一般处于1 177～1 250m，全年日照2 447.4h，日照率55%，烤烟生育期≥10℃年积温为2 900℃，降水量约630mm，蒸发量1 500mm，无霜期180d左右。光照充足，热量富裕。供试土壤为黑垆土，基本理化性状为：有机质12.5g／kg，全氮0.8g／kg，碱解氮64.6mg／kg，速效磷11.6 mg／kg，速效钾162.5mg／kg，pH值（水土比5∶1）为8.3。

1.2 试验设计与方法

田间试验设2个处理：CK，不施微生物有机肥；BIO，施微生物有机肥，每处理3次重复，随机区组排列，小区面积59.4m2（9.0m×6.6m），行距1.1m，株距0.6m，种植密度为1.515×104株／hm2。

微生物有机肥由南京农业大学提供，含氮磷钾8%，其中氨基酸态氮占总氮的60%以上，含抗土传枯萎病的微生物数量大于108／g。移栽时在靠近烟苗根系底部集中施用，用量4g／株，60kg／hm2。2个处理化肥用量一致，氮肥用量为60kg N／hm2，N∶P2O5∶K2O比例1.0∶1.5∶3.0，氮肥用硝铵磷（N含量32%，P2O5含量4.4%），磷肥用过磷酸钙（P2O5含量16%），钾肥用硫酸钾（K2O含量50%）。施肥和起垄同步进行，采用双层施肥技术，下层肥料于起垄时施入，开沟20cm深，条施80%的氮肥、磷肥和钾肥，上层肥料于移栽时施入，穴施全部微生物有机肥和剩余20%的氮肥、磷肥，20%的钾肥于现蕾期喷施。其余栽培和田间管理措施均按当地烟农习惯方法进行。

供试品种：当地主栽品种CV70，由正宁县烟叶生产管理局提供，烟苗采用切块育苗。

1.3 样品采集与分析

起垄前采集土壤基础土样，测定土样的基本理化性状。移栽后0～120d内每隔15d调查各小区烤烟叶片叶绿素含量。在田间条件下挑选无病虫害、无生理病斑、无机械损伤的烤烟中部完全展开叶片，采用SPAD－502型叶绿素仪于主脉两侧，分别读取3个读数，并用6个读数平均值代表该株烤烟的叶片叶绿素含量，每个小区随机选取健壮程度和长势一致的烤烟7株进行测定。同时取烤烟叶片混合样杀青、烘干后测定叶片氮素含量。圆顶期在田间于上午10点左右采集新鲜无病害特征叶片测定相关酶活性，用抖土法采集根际土壤。各项指标测定均3次重复，求取平均值。叶绿素降解速度＝（前一次测定SPAD值－后一次测定SPAD值）／间隔天数。

烤烟成熟收获后，于当地烤房内进行烘烤，按小区分下部叶（从下至上第1～7位叶，去掉1～2片无效叶，共采收5片有效烟叶）、中部叶（第8～14位叶）和上部叶（第15～20位叶）各取烤后烟叶混合样测定致香成分。样品致香物质测定在河南农业大学烟草学院国家烟草（行业）栽培生理生化重点实验室进行，3次重复。

1.4 测定方法

叶片酶活性测定，硝酸还原酶：磺胺－萘胺比色法。蔗糖转化酶：3，5－二硝基水杨酸比色法。

土壤碱解氮含量测定：碱解扩散法。叶片氮素含量测定：H2SO4－H2O2联合消煮，蒸馏滴定法。

1.5 致香物质测定

1.5.1 中性致香物质的提取 中性致香物质提取及定性定量分析采用HP5890－5972气质联用仪。前处理采用水蒸气蒸馏－二氯甲烷溶剂萃取法。同时蒸馏萃取装置的一端接500mL圆底烧瓶，内有10g烟样、1g柠檬酸、350mL蒸馏水和0.5mL内标（硝基苯）混合液，使用恒温电热套进行加热；装置的另一端连接盛有40mL二氯甲烷的250mL圆底烧瓶，该烧瓶置于恒温水浴锅中加热，水浴温度为60℃。同时蒸馏萃取2.5h。萃取完成后，加入10g无水硫酸钠干燥有机相，然后于60℃水浴中浓缩至1mL左右即得烟叶精油。

1.5.2 中性致香物质的定性和定量条件 将提取的烟叶精油，由GC／MS鉴定结果和NIST库检索定性。GC／MS分析条件，色谱柱：HP－5（60m×0.25mm×0.25μm）；载气：氦气；流速：0.8mL／min；进样口温度：250℃；传输线温度：280℃；离子源温度：177℃。升温程序：初温50℃，恒温2min后，以2℃／min的速度升至120℃，5min后以2℃／min的速度升至240℃，保持30min；分流比15∶1；进样量：2μL；电离能：70eV；质量数范围50～500；采用内标法定量。

1.6 数据处理

用DPS数据处理软件对试验数据进行统计分析，图表绘制在Excel 2007软件上进行。

2 结果与分析

2.1 施用微生物有机肥对烟叶中性致香物质总量的影响

烤后烟叶样品经GC／MS测定和NIST库检索共定性和定量了28种主要中性致香成分，将这些致香成分按烤烟香气物质前体物共分成6类（表1）。

微生物有机肥处理BIO显著提高了烤烟各部位叶片的中性致香物质总量，与CK相比，增加了26.79%～134.33%，并以上部叶的增幅最大，总量高达1 810.72μg／g，说明在常规施用化肥的基础上增施微生物有机肥能显著提高烟叶中性致香物质总量，提升烟叶的香味品质。

烤烟不同叶位叶片的中性致香物质总量对微生物有机肥的反应显著不同，以上部叶片的致香物质总量对微生物有机肥的敏感程度最高，含量的增幅最大。与CK相比，上、中、下部叶的中性致香物质总量分别增加了134.33%，81.03%和26.79%。

施用微生物有机肥后，不同叶位叶片的中性致香物质总量的高低顺序发生了变化，CK处理中各部位叶片中性致香物质总量高低顺序为上部叶＞下部叶＞中部叶，而在BIO处理中为上部叶＞中部叶＞下部叶，这可能是微生物有机肥影响烟株体内干物质和氮素在不同叶位叶片间的分配所致。在收获的18片烟叶中，中部叶为第8～14片叶，占收获叶片的39%，中部叶致香物质总量的提高对增加烤烟单位面积的产值具有重要意义，烟叶致香物质含量越高，品质越好，中上等烟比例也越高，单位面积的产值越高。

2.2 施用微生物有机肥对不同种类中性致香物质的影响

烟叶中致香物质成分较多，不同致香物质具有不同的化学结构和性质，对人的嗅觉和味觉可以产生不同的刺激作用，形成不同的感官反应，对烟叶香气质、香气量和香型有不同的贡献［16］。结果显示（表1），正宁烟叶中性致香成分有西柏烷类降解产物1种，类胡萝卜素降解产物13种，苯丙氨酸类降解产物4种，棕色化产物6种，新植二烯和其他致香物质3种。含量较高的致香物质组分主要有茄酮、β－大马酮、香叶基丙酮、法尼基丙酮、苯甲醇、糠醛、3，4－二甲基－2，5－呋喃二酮和新植二烯等，较低的有氧化异佛尔酮、6－甲基－5－庚烯－2－醇和4－乙烯基－2－甲氧基苯酚等。

微生物有机肥处理对六大类中性致香物质的效果明显不同（表1），BIO处理大幅度提高了上部叶片中西柏烷类和类胡萝卜素类致香成分总量以及中部叶苯丙氨酸类致香成分总量，较CK分别增加了67.57%，79.78%和261.78%，而棕色化产物类致香成分总量处理间差异不大。

测定结果同时表明，中性致香物质以新植二烯为主，占中性致香物质总量的79.67%～89.43%，而且处理间的差异也最大，这是导致处理间致香物质总量形成巨大差异的主要原因，与赵铭钦等［17］的研究结果一致，BIO处理中上、中、下部叶片中新植二烯的含量分别比对照增加了157.33%，88.15%和31.17%，这可能是施用微生物有机肥后土壤的供氮能力增强，促进了新植二烯的前体物－叶绿素的合成所致。

2.3 施用微生物有机肥对烟叶叶绿含量的影响

叶绿素不仅是光合作用的重要色素，同时其含量和降解产物的积累量与烟叶的香气物质和品质有密切关系［18］。BIO处理不仅提高了烤烟叶片的叶绿素含量，而且推迟了叶绿素含量的峰值（图1）。

结果显示，两处理叶片叶绿素含量均表现为“先上升，后下降”的单峰曲线（图1），但是峰值出现的时间明显不同。CK处理叶绿素的峰值出现在移栽后60d左右，BIO处理出现在移栽后75d左右，推迟了大约15d。

叶绿素含量降低是植物重要的衰老指标之一，常常被用来作为植被长势的重要参量［19］。叶片衰老最明显的表现就是叶绿素逐渐消失，并伴随叶片黄化以及最终脱落。烟叶的成熟（衰老）过程即是叶绿素大量降解的过程［20－23］，BIO处理叶绿素峰值的延后说明施用微生物有机肥延缓了烤烟成熟期。在烤烟生育后期，CK叶片叶绿素降解速度为0.41单位／d（移栽后60～105d），BIO处理为0.32单位／d（移栽后75～120d）。CK叶绿素后期降解较快，烟株干物质积累较低，不耐衰老，造成一种“假熟”现象，导致相同部位烟叶提前采收，烟叶成熟时间也较BIO处理缩短。刘峰等［24］通过菜籽饼肥研究试验也表明随着有机肥的施用烟株的脚叶和顶叶成熟时间推迟，烟叶成熟期被相对拉长。

烤烟的成熟期主要进行内在物质特别是香气前体物质的生理生化转化，成熟期的长短决定这种转化能否充分进行，对烤烟内在品质产生重要影响［3，7］。微生物有机肥延缓了烟叶叶绿素的降解速度，延长了烟叶的成熟期，使最能体现烤烟品质的中、上部叶片的生理功能期延长，有利于叶片干物质的积累和化学成分及叶片内含物的转化。

2.4 施用微生物有机肥对土壤有效氮和烟叶氮含量的影响

在圆顶期测定了烟株根际和非根际土壤的有效氮含量（图2），发现BIO处理较CK分别增加了18.66%和36.79%，说明施用微生物有机肥显著增强了土壤的供氮能力。这主要是因为微生物有机肥本身含有一定量的有效氮，同时也促进了土壤有机氮的矿化所致。土壤供氮能力的提高，促进了烟株对氮的吸收，进而促进了叶绿素的合成。在整个大田生长期内BIO处理的叶片N素含量均高于CK（图3）。

图1 施用微生物有机肥对烤烟叶片叶绿素含量的影响Fig.1 Effects of bio－organic fertilizer application on chlorophyll contents in tobacco leaves

图2 微生物有机肥对土壤碱解氮含量的影响Fig.2 Effects of bio－organic fertilizer on available nitrogen in soil

图3 微生物有机肥对烤烟叶片氮素含量的影响Fig.3 Effects of bio－organic fertilizer on nitrogen contents in tobacco leaves

表2 微生物有机肥对圆顶期烤烟叶片C／N代谢关键酶活性的影响Table 2 Effects of bio－organic fertilizer application on activities of key enzymes in C／N mechanisms in tobacco leaves on dome period

2.5 施用微生物有机肥对圆顶期烤烟C／N代谢关键酶活性和叶片干物质的影响

蔗糖转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转移、利用及植物细胞代谢和生长强度的指标，也是碳代谢的重要标志［25］，BIO处理极显著提高了圆顶期叶片蔗糖转化酶活性（表2），较CK上升了30.02%，该酶活性的大幅度提高说明施用微生物有机肥能提高叶片的碳代谢强度，促进烤烟后期同化产物向小分子有机酸、醛类、酮类等叶片致香物质的方向转化和形成。

硝酸还原酶是高等植物氮素同化过程－硝酸光合作用的限速酶，其活性大小与氮代谢呈正相关，常用来表示氮代谢强度［13，25］。BIO处理的硝酸还原酶活性比对照增加了13.42%（表2），说明BIO处理促进了叶片的硝酸光合作用，促进了NO3－的还原作用，进而促进了氨基酸和蛋白质的合成。

3 讨论

3.1 烤烟叶片叶绿素对施用微生物有机肥的响应

新植二烯是由叶绿素裂解产生的叶绿醇脱水形成，为烟叶中重要的萜烯类化合物，能增进香烟的吃味和香气，本身有一种弱的令人愉悦的气味，又可通过降解转化形成其他低分子致香成分［7］；有研究表明新植二烯是烟叶中性挥发物中含量最大的成分，可能是烟叶形成清香特色的主要因素之一［18］。BIO处理烟叶叶绿素含量提高，可能有几个原因：1）微生物有机肥施用后，土壤氮素供应的增强能够使叶片积累更多的氮素用于叶绿素的生物合成。有研究表明叶绿素含量和烤烟叶片全氮之间存在极显著的线性关系，且相关系数在各个测定时间均为显著或极显著正相关［26］。据测定，叶绿体占叶片干重的20%～30%，而叶绿体中含蛋白质45%～60%，约有3 000多种各类蛋白［27，28］。BIO处理烟株氮素代谢的增强使得更多的氨基酸和蛋白质得以合成，能够完善叶绿素－蛋白复合体的组织结构和叶绿体内囊体膜的功能，增加烟叶对叶绿素a和b的“库容量”。2）施用微生物有机肥提高烟叶蔗糖转化酶的活性，增强烟株的碳代谢强度，为叶绿素的生物合成提供更多的碳骨架和能量［29］。3）微生物有机肥中氨基酸态氮占总氮的60%以上，在化学肥料施用的基础上，随着微生物有机肥的施用，少量的有机氮素进入土壤，这些有机氮素特别是氨基酸态氮可能也是影响烤烟叶片叶绿素含量的重要因素。武雪萍［30］研究发现，外源氨基酸的使用，不仅能提高叶片氨基酸的积累量，同时增强了烟叶叶绿体色素的合成，叶绿素a、叶绿素b与类胡萝卜素的含量都有所增加。

3.2 施用微生物有机肥对烤烟成熟度的影响

烟叶采收成熟度是确定烤后烟叶形成最终产品的重要因素，也是烟叶质量的核心，充分成熟的烟叶不仅易于烘烤，烤后烟叶外观质量高，而且醇化效果好，香气量足，吸食效果佳［31］。新植二烯和大多数中性香味物质的含量及醛类、酮类、醇类的总量都随着成熟度的增加而呈增加趋势［32］，成熟时烟叶的糖含量高，总氮、烟碱含量适宜，各种化学比值协调，烟叶香气量足，香气质好，杂气、刺激性明显减轻，总体香、吃味最好，而成熟不够或者过熟的烟叶，其内在质量明显降低［33］。在本试验中，BIO处理烟叶的成熟期相对延长，烟叶不仅生理成熟，且内在物质的生理生化反应因后期植株C／N代谢的加强而能够转化充分进行，烟叶香味质量达最佳状态；CK处理烟叶叶绿素后期降解较快，烟株不耐衰老，烟叶在没有达到生理成熟之前，就停止了自身的生长和干物质积累，同时进行大量的营养物质消耗或转移，导致烟叶外观呈黄化状态，未老而先衰，属于一种“假熟”状态［7，23］。近年来当地农户滥用化肥，忽略有机肥的施用，导致土壤板结、保水性差，土壤有机质含量下降，生物活性降低，磷肥、钾肥及微量元素等养分的利用率不高，难以满足烤烟生长所需营养和平衡，这些外在环境的胁迫是造成烟株早衰的重要原因。同时长期的连作造成土壤有害病原菌繁衍，微生物多样性失调，土壤生态肥力下降严重，烟株抗逆、抗病能力不高，这也导致了烟叶致香成分含量较低，香气质量不佳。苏海燕等［34］研究发现，新植二烯、类胡萝卜素类和苯丙氨酸类致香成分随连作阶梯下降，类西柏烷类和棕色化产物总体上呈降低趋势，这对于烤烟生产来说严重不利。

微生物有机肥原料来源广泛，其成分、组成比例、含量肥料种类间差异较大，其对于烤烟叶片致香物质的影响可能是包括有益微生物和促生物质在内的各种肥料成分共同作用的结果，因此，在下一步的研究中有必要对其各种成分进行分解试验，深入研究，以找出微生物有机肥对烤烟叶片香味品质影响的机理。

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