韩明鹏，王彦华，高永革，张晓霞，苏芳蕊，许红，王成章＊

（1.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州450002；2.河南省饲草饲料站，河南 郑州450008；3.河南农业大学信息与管理科学学院，河南 郑州450002）

紫花苜蓿（Medicagosativa）是在世界范围内栽培历史最悠久、面积最广泛的豆科牧草，堪称“牧草之王”［1］。紫花苜蓿具有产草量高、富含蛋白质、生物固氮能力强和适应性广的特性，对我国畜牧业的发展、食品安全等具有重大作用。但随着人类活动的增加，全球气温逐年上升，高温热害变得非常突出，严重抑制植物特别是紫花苜蓿的生长发育，影响到紫花苜蓿的产量和品质［2，3］。高温能使紫花苜蓿植株生长缓慢、枯萎甚至死亡，病虫害增多，产量和品质下降，是限制其推广利用的重要环境因子之一。目前高温对紫花苜蓿的研究方面主要集中在高温对紫花苜蓿生产性能的影响、紫花苜蓿适应高温胁迫的机制及其耐热性评价指标的选择和可靠性评价的方法等方面［4－7］，而针对在分子水平寻找紫花苜蓿耐热基因的研究还未有报道。

耐热性是目前抗性研究中的一个重要方面，但耐热性是一个非常复杂的性状，长期以来人们对紫花苜蓿耐热性的了解主要来自于生理学的研究，如有机溶质的积累和热诱导蛋白的产生等［8－10］。随着分子生物技术的发展，人们对耐热性的了解逐渐深入到分子水平。由于植物的高温胁迫反应是一个多基因参与的系统调控过程，尽管传统的研究方法已取得一些成果，但是要想从根本上阐明高温胁迫机制尚有很大差距。这就需要在全基因组水平上对其进行整合性研究。随着生物技术、基因组学和生物信息学的发展，目前已出现了一系列大规模分离差异表达基因的方法。

抑制性消减杂交技术（SSH）是由Diatchenko等［11］于1996年以mRNA差异显示技术为基础建立起来的筛选未知差异基因的新技术。采用该技术在较短时间内即可获得差异表达基因的cDNA片段，可使低丰度的mRNA得以高于1 000倍以上的富集，从而使某些低丰度表达的mRNA有望被检出［12］。近年来SSH技术在植物抗逆性研究上展现了良好的应用前景。刘春燕等［13］构建了大豆花叶病毒胁迫诱导的消减文库并对其进行了初步分析，研究了花叶病毒胁迫下大豆基因的表达调控。夏卓盛等［14］以铝离子胁迫的紫花苜蓿幼根为材料，构建了紫花苜蓿铝胁迫的抑制消减文库，研究了铝胁迫下的基因差异表达。Jin等［15］以盐胁迫的紫花苜蓿10日龄幼苗为材料，构建了紫花苜蓿盐胁迫的抑制消减杂交文库，对文库及其部分耐盐基因进行了分析。而SSH文库在紫花苜蓿抗热性研究方面的报道很少。

本研究以秋眠6级的紫花苜蓿ABI 700为材料，采用抑制性消减杂交技术构建了高温胁迫下紫花苜蓿幼嫩茎叶的正向抑制消减cDNA文库，旨在为紫花苜蓿耐热机制研究和耐热相关基因的克隆提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本试验以秋眠6级的紫花苜蓿（ABI 700）为材料，产地为美国，以45℃高温处理过的幼嫩茎叶为处理组（tester），以同一植株正常条件（22℃）下生长的幼嫩茎叶为对照组（driver）。整个试验于2010年5月－2010年10月在中国农业科学院棉花研究所（安阳）重点实验室进行。

1.1.2 菌株及载体 大肠杆菌（Escherichiacoli）菌株 DH5α电转化感受态细胞（E.coliElectro－Cell DH5α）、pMD 18－T Vector［（抗性标记为氨苄青霉素（Amp）］，购自 TaKaRa公司。

1.1.3 试剂和酶 总RNA提取试剂盒RNAiSo Plus、mRNA纯化试剂盒OligotexTM－dT30＜Super＞mRNA Purification Kit、DNA片段纯化试剂盒 TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0、Taq DNA 聚合酶均购自TaKaRa公司；抑制消减杂交试剂盒PCR－SelectTMcDNA Subtraction Kit和聚合酶 Advantage cDNA Polymerase Mix购自Clontech公司；其他生化试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取和mRNA的分离纯化 紫花苜蓿幼嫩茎叶总RNA的提取采用宝生物公司（TaKaRa）的RNAiso Plus试剂，经紫外分光光度计测定后，置于－70℃冰箱保存。mRNA的分离纯化使用宝生物公司（TaKaRa）的 mRNA纯化试剂盒 OligotexTM－dT30＜Super＞mRNA Purification Kit，按照试剂盒说明书纯化mRNA，并用紫外分光光度计检测其浓度，立即进行下一步实验。

1.2.2 抑制消减杂交（SSH） 具体实验步骤按照 Clontech公司（美国）的 PCR－SelectTMcDNA Subtraction Kit的方法进行。以45℃高温胁迫下的紫花苜蓿幼嫩茎叶为试验方（tester），以正常条件下（22℃）生长的紫花苜蓿幼嫩茎叶为驱动方（driver），把从总RNA中分离纯化的tester和driver组的mRNA分别逆转录成双链cDNA，然后用四碱基序列的限制性内切酶Rsa I将其充分酶切。酶切产物用常规的酚、氯仿和异戊醇纯化。将酶切过的tester cDNA平均分成2份，在T4DNA连接酶的作用下分别与接头1和2R连接，16℃连接过夜，制成tester－1cDNA和tester－2RcDNA，并进行接头连接效率的分析。对已经加上接头1和2R的tester cDNA分别与过量的未加接头的driver cDNA进行第1次消减杂交，杂交条件为98℃1.5min，68℃8h。之后，再加入新鲜变性的driver cDNA于第1次杂交的2组产物中，68℃杂交过夜，结束后加入200μL无菌水进行稀释，混匀，68℃温浴7 min。杂交稀释后，根据接头1和2R外侧序列设计的PCR（聚合酶链式反应）引物1对消减杂交产物进行第1次PCR扩增；第1次PCR扩增产物用无菌水稀释10倍，再用巢式PCR引物Nested primer 1和Nested primer 2R进行第2次PCR扩增。具体接头和引物序列见产品使用说明书。

1.2.3 cDNA消减文库的构建 第2次PCR产物经TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0纯化后，取4μL与pMD 18－T Vector克隆载体连接，16℃连接过夜，经乙醇沉淀后，取2μL加入电转化感受态细胞（E.coliElectro－Cell DH5α）中，混合液注入于冰水中预冷的0.1cm 电击杯（Bio－Rad）中。1.5kV 电压、200Ω电阻冲击后，向电击杯中迅速加入1mL预冷的LB培养基。将菌液置于离心管中37℃振荡培养1h（180 r／min）。取100μL涂于含有氨苄青霉素的LB／X－gal／IPTG的固体平板上，37℃培养过夜，放入4℃冰箱1h充分显色。培养皿上可见蓝白分明的菌落。剩余培养液加入甘油，液氮速冻后，－70℃保存。

1.2.4 PCR鉴定重组子 随机挑取120个白色单菌落，接种于含1mL LB液体培养基（含氨苄青霉素）的离心管中，37℃轻摇6～8h。直接取1μL菌液作为PCR模板，以Nested primer 1和Nested primer 2R作为引物，PCR扩增插入片段。10μL的反应体系：模板1μL、Nested primer 1（10μmol／L）0.8μL、Nested primer 2R（10 μmol／L）0.8μL、dNTP（2.5mmol／L each）0.8μL、10×PCR buffer 1μL、Taq酶0.3μL，补无菌水至总体积为10μL。反应程序：94℃10min；94℃30s，66℃30s，72℃90s，30个循环；72℃5min。PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测。将单克隆菌液加入无菌甘油至终浓度15%，用液氮速冻后，置于－70℃冰箱长期保存。

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取和mRNA的分离纯化

总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，其28S和18SRNA带型清晰可见，且比例适当（图1）。紫外分光光度计检测其 OD260／280在1.9～2.0，表明总RNA质量好，纯度高，满足文库构建的要求。总RNA经纯化试剂盒纯化后，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，可见其带型呈弥散状（图1），紫外分光光度计检测其OD260／280≈2.0，表明纯化后的mRNA质量好，纯度高，满足文库构建的要求。

2.2 cDNA合成以及cDNA酶切效果分析

mRNA反转录为双链cDNA后用限制性四碱基内切酶Rsa I酶切，经1%的琼脂糖凝胶电泳分析反转录及酶切效果。结果表明（图2），反转录后的双链cDNA片段大部分集中在1 000～3 000bp，符合实验的要求。酶切后的片段明显较未经酶切片段减小，说明酶切比较完全，可以用于下一步实验。

2.3 接头连接效率检测

dscDNA与接头连接效率的高低是决定抑制性消减杂交成败非常关键的一步。利用紫花苜蓿管家基因Actin的3′端（GCCGACCTCGTCATACTGGT）和5′端（TCTTTTGGATTGGGCTTCGT）特异引物（产物83bp）以及试剂盒所带的3′端特异引物与PCR Primer 1（产物）对2组分别连接有 Adaptor 1（接头1）和Adaptor 2R（接头2R）的tester cDNA 进行PCR扩增，产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果显示（图3），管家基因的3′端特异引物与接头的外侧引物Primer 1组合的扩增片段（连接接头的PCR产物）大于管家基因3′端、5′端特异引物组合的扩增片段，与预期结果一致，灰度分析表明2组dscDNA接头连接效率均在50%以上，接头已经成功的连接。

图1 紫花苜蓿幼嫩茎叶总RNA及mRNAFig.1 Total RNA and mRNA from tender stems and leaves of alfalfa

图2 紫花苜蓿反转录cDNA Rsa I未酶切与酶切Fig.2 Reverse transcription cDNA of alfalfa after Rsa I digestion and not Rsa I digestion

2.3 消减杂交效率的检测

以蒺藜状苜蓿的管家基因α－tubulin为依据，设计引物进行消减杂交效率的检测。引物序列为：3′（CACATTGCAAGCCGGTATGT）和 5′（ACCGGTCTCACTGAAGAASG）。同时，以未经抑制性消减杂交的cDNA T l－c（在制备tester cDNA 连接2种接头时，将刚加好样还没有进行连接反应的连接有Adaptor 1和Adaptor 2R的tester cDNA 各取2μL混合，然后进行连接反应即可）作为对照进行PCR。PCR反应条件为：94℃预变性2min，然后94℃30s，55℃30s，72℃1min扩增，并分别在第18，23，28和33循环处各取5 μL进行电泳，检测消减杂交效率。结果如图4所示，未消减产物中看家基因147bp片段在第28循环时出现，而消减产物中看家基因147bp片段未出现。由此可见，消减产物中看家基因表达丰度已大大下降，消减杂交已有效完成。

2.4 消减PCR结果

第1次和第2次PCR扩增结束后，分别取tester消减、tester未消减、对照RNA消减、对照RNA未消减、PCR阳性对照产物6μL并排进行电泳检测。消减杂交第1次PCR结果（图5）显示，第1次PCR扩增的电泳带较弱，经抑制消减杂交后扩增出的cDNA片段大小介于250～1 000bp，而未经抑制消减杂交处理扩增出的cDNA片段大小介于100～2 000bp，并且经过消减杂交后扩增出的PCR产物亮度明显弱于未经过消减杂交的PCR产物，这也说明消减杂交有效的完成。消减杂交第2次PCR结果（图6）显示，经过2轮消减杂交和2轮PCR后，消减杂交后扩增出的PCR产物亮度和未经过消减杂交的PCR产物相当，tester中的差异表达基因得到有效地富集和扩增，这也说明消减杂交是成功的。

2.5 消减文库中插入片段的PCR鉴定

经过2次选择性PCR富集的消减产物第2次PCR产物纯化后与pMD－18T进行连接，转化到DH5α电转化感受态细胞（E.coliElectro－Cell）中培养扩增，得到消减文库。对阳性克隆进行菌液PCR鉴定插入片段，引物采用第2次PCR时的巢式引物1和2R。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测（图7）显示，文库克隆的重组率为99%，片段大小集中分布于250～750bp。

2.6 cDNA文库的滴度和重组率测定

从cDNA文库中取50μL，涂于含IPTG和X－gal的平板上，培养过夜后，计算菌斑个数，按下式计算cDNA文库的滴度。分别计数蓝斑和白斑的个数，计算重组率。结果表明，文库滴度为4 230pfu／mL；重组率为97.8%。

2.7 BlastX分析及功能的预测

随机挑取120个白色菌落进行PCR鉴定，其中的阳性克隆送至北京华大基因公司进行测序。将测得的序列去除引物、接头和载体序列，提交到NCBI（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）进行序列比对，部分比对结果如表1。

图3 接头连接效率检测Fig.3 Detection of ligation efficiency of adapor

图4 消减杂交效率检测Fig.4 PCR analysis of subtraction efficiency

3 讨论

Diatchenko等［11］于1996年建立了一种应用PCR方法的抑制消减杂交技术。抑制消减杂交技术利用了消减杂交技术、限制性内切酶与抑制性PCR相结合的方法，经过2次杂交和2次PCR，以富集和获得目标片段，具有以下优点：1）假阳性率被大大降低，可获得较多的特异性表达产物，阳性率达94%［16］；2）具有高敏感性，均等化富集目标片段，避免了表达序列标签（expressed sequence tag，EST）分析中高丰度基因重复测序的缺点，使得低丰度mRNA也能被检测到［17］。因此SSH技术被广泛应用于植物差异表达基因的分离［18－21］。

图5 消减产物第1次PCRFig.5 The first PCR products of subtracted

图6 消减产物第2次PCRFig.6 The second PCR products of subtracted

图7 PCR检测消减cDNA文库克隆插入片段Fig.7 Identification of the inserted cDNA fragments in subtractive cDNA library by PCR

表1 SSH cDNA文库的BlastX分析及其功能蛋白的预测Table 1 BlastX analysis of SSH cDNA library and the prediction of functional proteins

本研究首次建立了紫花苜蓿高温胁迫下差异表达基因的抑制消减cDNA文库，对SSH文库的各个关键步骤如：总RNA及mRNA质量、Ras I的酶切效果、接头的连接效率、消减效率和转化效率等的检测显示，消减文库有较高的质量。构建一个好的差异表达cDNA文库对起始mRNA的完整性和纯度要求非常高。本试验的结果表明，试验获得的总RNA含量高，完整性好，紫外分光光度计检测其OD260／280在1.9～2.0。mRNA的完整度和纯度也达到了文库构建的要求，紫外分光光度计检测其OD260／280≈2.0。本试验抑制消减杂交试验中，从反转录合成cDNA及Ras I酶切的检测、加接头后的接头连接效率到消减cDNA片段的消减效率分析，都随时监控着各个试验环节，保证最终获得高质量的差异表达cDNA文库。利用T／A克隆技术，将特异性扩增的PCR产物直接与T载体进行连接，文库的构建采用DH－5α电转化感受态细胞，大大提高了文库的转化效率。扩增文库后，经过初步蓝白班筛选120个阳性克隆，菌落PCR扩增电泳图谱检测，文库滴度为4 230pfu／mL，文库克隆的重组率为97.8%，片段长度集中分布于250～750bp。这些结果直接说明获得了高质量的正向差异表达cDNA文库。

综上所述，利用SSH技术构建紫花苜蓿高温胁迫差异表达基因文库，通过EST技术研究抗热过程差异表达的抗热相关基因的表达情况，从总体上阐述紫花苜蓿抗热机制已成为可行的研究方法。抗热基因的研究不仅仅是抗热过程的识别和抗热基因的开启，更是注重抗热过程中系列基因的表达以及抗病信号的传递和级联反应，这将更加有助于对抗热机制的深入研究。

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