韩永芬，卢欣石，舒健虹，付薇，陆瑞霞，覃涛英

（1.北京林业大学林学院草业科学，北京100083；2.贵州省草业研究所，贵州 贵阳550006）

菊苣（Cichoriumintybus）为多年生草本植物，是一种高产优质的饲用牧草，原产于地中海、中亚和北非。菊苣在国外主要用于蔬菜和制糖原料及咖啡代用品。目前，我国登记了2个菊苣品种普那菊苣、将军菊苣，均为引进品种。普那菊苣（Cichoriumintybuscv.Puna）是20世纪80年代新西兰科工部草地研究所培育出的菊苣饲用新品种，1985年正式鉴定通过并推广利用［1］，贵州省草业研究所1997年从新西兰引进种植，通过引种驯化，并对其进行选育研究，于2005年9月通过贵州省农作物品种审定委员会审定命名为黔引普那菊苣，现已在生产中大量推广应用。

Damato［2］1991－1993年研究了播种期、种植密度对菊苣种子产量的影响，研究结果表明，意大利半岛11月或3月播种，密度以11.1株／m2效果较好，种子产量可达639kg／hm2。新西兰Hume等［3］1986－1995年对利用普那菊苣建植的混播草地进行了绵羊放牧利用研究，设计了不同混播组合、放牧频率、利用年限等，在4年内混播草地中普那菊苣所提供产草量在第1～3年增加，第4年减少，提供干物质占混播草地的34%，80%，85% 和57%，普那菊苣、高羊茅（Festucaarundinacea）、大网茅草（Bromuswillednowii，prairie grass）混播是比较好的组合。Boyd和Rogers［4］1997－2003年对普那菊苣的耐盐性进行了研究，认为在200mmol／L NaCl浓度下，仍生长良好。国内主要是在引种的基础上开展相关研究，熊先勤等［5］研究了菊苣的生长发育规律，韩永芬等［6］对普那菊苣高产配套栽培技术、不同刈割利用方式进行了研究，左相兵等［7，8］对饲喂肉兔、三元杂交猪进行了试验，刘凤霞等［9］对菊苣种子生产技术进行了研究，孙变姿等［10］对菊苣叶提取物对粘虫的生物活性进行了研究，研究对象均为引进品种，没有具有自主知识产权的新品种。

在菊苣遗传多样性研究方面国外有部分相关报道，Van Cutsem等［11］采用扩增片断长度多态性（AFLP）标记对菊苣野生种和栽培种之间的基因流动进行了研究；Baes和Van Cutsem［12，13］用同工酶，Kiers等［14］及Koch和Jung［15］用相关序列扩增多态性（RAPD）和AFLP标记说明菊苣栽培种中存在着丰富的遗传多样性；国内，罗燕等［16］利用相关序列扩增多态性（SRAP）分子标记技术对不同地理类群的菊苣材料进行了研究，相同或相似地理来源和气候类型的材料能基本聚在一起，说明遗传多样性与地理来源和气候类型有一定的关系，而在菊苣诱变材料之间的研究没见相关报道。

航天诱变在苜蓿（Medicagosativa）、红豆草（Onobrychistaneitica）、沙打旺（Astragalusadsurgens）等豆科牧草上有所应用，并表现出较好的诱变效果［17］。该研究通过对2006年实践八号育种卫星搭载返回的黔引普那菊苣种子为选育材料，经几代选育后培育出的新品系进行形态特征比较、RAPD分析及生产性能研究，创造出生产性能好具有自主知识产权的新品系，弥补国内菊苣依赖进口，缺乏自主知识产权的空白，为菊苣新品种选育提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料来源

同时种植2006年航天搭载的黔引普那菊苣材料和地面对照种子，筛选优良的突变材料。SP1代生长期间调查出苗率、存活率、株高、花序长、畸变株率和不育株率等，并与对照植株进行比较，淘汰白化苗、畸变株等。其余正常株孕蕾后套袋，单株收种，将每序脱粒混合起来，用作为SP2代的筛选材料。生长期间在群体中进行观察调查，以发现有利变异植株。收获前再根据育种目标对入选脱粒时结合考种，淘汰性状不良的单序，并分单株进行筛选，入选单株分别收获脱粒，分别装代编号，作为播种SP3代的材料，目前选育到SP4代，获变异材料27份，现表现较稳定，另加上PA－57（黔引普那菊苣）和PA－36（将军），共计材料29份。试验材料于2009年9月12日种植于贵州省草业研究所独山试验基地，取样进行RAPD分析的时间为2010年3月4日。

1.2 诱变品系的RAPD分析

1.2.1 DNA的提取 采用宝生物工程（大连）有限公司（TakaRa）植物基因组DNA提取试剂盒。

1.2.2 引物的筛选及反应体系 选2个DNA样品作模板，对赛百胜公司的100个RAPD引物分别进行PCR扩增筛选，从中选取了15个多态性高、重复性好的引物，在29个种质之间进行PCR扩增，反应体系为：反应总体积为25μL，内含10×buffer，MgCl21.5mmol／L，dNTPs 150μmol／L，TaqDNA聚合酶0.5U，引物1μmol／L，模板30ng，在BIO－RAD公司生产的 MyCyclerTMPCR仪上进行如下程序：92℃3min；92℃1min；35℃1min；72℃2min，循环45次；72℃延伸8min。

1.2.3 PCR扩增产物的检测 用1×TBE缓冲液配制1.2%（W／V）的琼脂糖凝胶，PCR扩增结束后，在每个样品中加入4μL电泳指示液（溴酚蓝0.25%，蔗糖40%）混匀，每个泳道上样22μL，选择合适的相对分子质量标记（如1 000，750，500bp），在180V电泳2～3h，将凝胶浸于0.5μg／mL的EB溶液中染30～60min，用水清洗凝胶（约10min），在BioSensSC810系列凝胶成像系统上观察，拍照。

1.2.4 数据记录与统计 RAPD为显性标记，同一引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性。将PCR扩增的DNA电泳条带作为位点记录下来，若某个扩增产物在一个样品中出现，记作“1”，未出现的记作“0”。原始数据的整理采用Excel软件，利用NTSYS－pc计算遗传相似系数（DICE系数），并且进行非加权组平均法（UPGMA，unweighted pair－group method with arithmetic means）聚类分析。

1.3 诱变品系的形态特征及生产性能研究

于2009年9月12日将29个品系种植于贵州省草业研究所独山试验基地，4个重复，小区面积6m2，在莲座期每小区取10株共40株观察叶形、叶色（用草坪比色卡进行分级）、叶脉，并测量叶长和叶宽等。4个重复中留1个重复用于后期的生长观察，另3个重复用于鲜草产量测定。

2 结果与分析

2.1 菊苣RAPD多态性

15个RAPD随机引物在供试材料中共扩增出78条带，扩增片断大小从100bp到2 000bp（图1），其中63条具有多态性，总的多态性条带比率PPB（number of polymorphic bands）为87.77%，平均每个引物扩增出5.2条带（表1）。进一步比较各个引物的PPB值，有9个引物的多态性条带比率在80.00%以上，其中引物SA10、SB2、SC3、SC4、SC10、SC13的多态性比率达100%。

2.2 菊苣遗传相似系数

将扩增所得到的78条片段在NTSYS－pc下计算材料间的遗传相似系数（GS值）（表1）。GS值的变化范围为0.60～0.91。基于遗传相似系数，利用UPGMA法对供试材料进行聚类分析，在聚类图（图2）上品系PA－186单成1支，与其他材料之间的相似性较低；剩下的28份菊苣材料的相似性较高，集中为0.69～0.80，其中PA－51、PA－46又各单成1支，与其他材料之间的相似性较低。所选的29份菊苣材料中相似性最高的是PA－92和PA－26，相似性系数高达0.91，相似性最低的是PA－196和PA－18，PA－43和PA－41，两者之间的相似系数为0.60。

如果以0.74为参照值，29份菊苣材料可以分为6个类群，PA－57、PA－62、PA－92、PA－26、PA－52、PA－89、PA－36、PA－11、PA－93、PA－33为 1 个 类 群；PA－45、PA－95、PA－18、PA－14、PA－42、PA－23、PA－31、PA－96、PA－54、PA－82、PA－85、PA－49、PA－43、PA－8为1个类群；PA－20、PA－41为1个类群；PA－51为1个类群；PA－46为1个类群；PA－186为1个类群。

图1 引物SE18对菊苣扩增的RAPD图谱Fig.1 RAPD fingerprint of C.intybus with primer SE18

表1 引物、序列和扩增结果Table 1 Primers，sequences and amplified results

图2 29份菊苣材料的RAPD聚类分析树状图Fig.2 UPGMA dendrogram for C.intybus based on Nei－Li’s genetic similarity coefficients

2.3 形态特征变化

黔引普那菊苣叶片为披针形，突变后形态特征发生变化，出现椭圆形、羽状及披针形叶。并且有叶色变浅、叶色变深、叶片变薄、叶片变厚、叶脉出现紫红色等现象，其部分特征特性见表2，差异显著性检验见表3。

表2 形态学观察结果Table 2 Observation results of morphologic chatacteristic

续表2 Continued

表3 供试的29个菊苣品系生产性能Table 3 Production performance of 29 C.intybus provided in experiment

2.4 菊苣新品系牧草生产性能

参试29个菊苣品系在株高40cm时刈割，其年产草量结果见表3，经方差分析，产量差异达极显著水平（P＜0.01），产量高于目前主推品种黔引普那菊苣和将军的品系有PA－31、PA－43、PA－42、PA－95、PA－11、PA－186、PA－49、PA－20、PA－93、PA－82、PA－54、PA－96。

采用离差平方和法对29个菊苣材料进行聚类（图3），PA－31、PA－43、PA－42、PA－95、PA－11、PA－186、PA－49、PA－20、PA－93、PA－82为第1类群，产量较高；PA－54、PA－57、PA－36、PA－96、PA－26、PA－8、PA－89、PA－45为第2类群，产量中等；PA－92、PA－14、PA－85、PA－52、PA－46、PA－41、PA－33、PA－51、PA－62、PA－23、PA－18为第3类群，产量较低。

图3 29个菊苣品系产量聚类图Fig.3 Production dendrogram for 29 C.intybus strains

3 讨论与结论

从RAPD聚类结果和表型特征来看，相似性最高的2份材料PA－92和PA－26，两者找不到明确的对应关系，从外型看，一个为羽状叶，一个叶片为披针型，只有叶脉绿色这一共同点。相似性较低的PA－186和PA－18在叶型上基本一致，均为披针形，但叶脉颜色不同，一个为绿色，一个为紫色。而PA－43和PA－41相似性较低，从外型上看也明显不一致，一个为披针形叶，一个为羽状叶。但在第1类群中，从叶型上看，除PA－26以外，其余材料均为披针形叶，叶脉颜色以绿色为主。以前的研究表明RAPD方法得到的聚类图可以反映品种的亲本特征及育种历史，但是聚类结果与表型特征相关性却较差［18］，对聚类结果与表型特征不完全一致这一现象，该研究有与之相类似的结论。

从菊苣牧草生产性能聚类结果看，产量高于目前主推品种黔引普那菊苣和将军的品系有PA－31、PA－43、PA－42、PA－95、PA－11、PA－186、PA－49、PA－20、PA－93、PA－82、PA－57、PA－96共12个，且叶型集中为披针形叶和椭圆形叶。有PA－49、PA－11、PA－42、PA－95、PA－82、PA－93、PA－20等7个品系既高产又抗旱［19］，抗旱材料多数集中在RAPD聚类结果中的第2类群。对高产抗逆菊苣新品种选育具有非常重要的实际意义。

在生产利用中建植高产持久性人工草地时为了得到均一的形态外观，要求所选用品种的形态特征尽可能一致，但是，同时为了提高其抵抗外界生物及非生物胁迫的能力，则品种之间要求有较高的遗传多样性。在检测的29份菊苣材料中，形态特征较一致而相似性系数较低的材料，如PA－93、PA－82都是披针形叶，叶色深绿达9级，有绒毛，叶脉绿色，且比较抗旱、高产，所以适合一起混播建植人工草地。

菊苣作为一种引进牧草品种，国内资源稀有，虽有对不同品种及地域的种质资源进行分析研究的相关报道［11－16］，但从总的来说，研究相对于其他牧草［20］还有差距，目前所获得有关菊苣遗传多样性的信息相对很少，该内容为菊苣研究提供了较为丰富的种质资源，且这样的信息对于构建分子遗传图谱的作图群体及明确种质资源收集和利用目标非常重要。所以，在今后的研究中，应该通过分子标记建立菊苣分子遗传图谱，并加强对该研究中选出的高产抗旱材料进行深入研究，这将有助于检测植物种内的遗传变异和分析基因组的结构组成［21］，定位和克隆重要的农艺基因（如抗病、抗旱基因）［22］，检测和标记数量性状位点（QTLs），并应用于分子标记辅助育种以改良植物重要农艺［23，24］，及通过采用DNA标记的原位杂交方法构建特定染色体的物理图谱［25］，为其在生产中应用提供科学的理论依据。

航天诱变在苜蓿、红豆草、沙打旺等豆科牧草上有所应用，并表现出较好的诱变效果［17］。本研究首次将航天诱变应用于菊科植物菊苣，获得了部分优良突变材料且能够稳定遗传，进一步验证了航天诱变处理变异频率高、良性变异多、稳定快的特点。证明通过航天诱变诱导菊苣突变体是有效的，为进一步利用航天诱变，建立突变体库提供了依据。

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