胡啸玲,汤恢焕*,徐海帆

(1.中南大学附属湘雅医院普通外科,湖南长沙410008;2.南华大学附属第一医院肿瘤外科)

P53上调凋亡调控因子(PUMA)可以通过P53依赖途径及其他促凋亡途经促进细胞凋亡,在肿瘤的发生过程中及治疗中发挥着重要作用[1-3]。C-myb是一种核内癌基因,在多种类型细胞包括恶性肿瘤细胞增殖分化过程中起极其重要作用[4];其表达水平与一些恶性肿瘤发生、进展、临床生物学行为及预后密切相关[8-13]。作者应用免疫组化法研究结肠癌及其癌旁组织中PUMA和C-myb表达水平及其临床病理意义。

1 材料与方法

1.1 标本分组及临床病理资料

收集本院2001年1月至2002年12月结肠癌手术切除标本 54例。男性26例(48.2%),女性28(51.8%);年龄范围24岁-82岁,平均(59.80±13.67)岁,其中≤50岁13例(24.1%)和＞50岁 41例(75.9%)。病理类型均为腺癌,其中高分化腺癌26例(48.2%),中分化腺癌15例(27.8%),低分化腺癌7例(13.0%),黏液腺癌6例(11.1%)。癌细胞侵袭深度包括粘膜下层3例(5.6%)、至深肌层20例(37.0%)和至浆膜层或浆膜外31例(57.4%)。共有 19例发生区域淋巴结转移(35.2%),8例(14.8%)发生远处器官转移(均为肝脏)。Dukes分期A+B 21例(38.9%)和C+D 33例(61.1%)。另收集以上结肠癌中癌旁非癌组织(距癌组织≥5 cm)30例,病理证实正常组织15例(50.0%)、轻度不典型增生7例(23.3%)、中度不典型增生5例(16.7%)和重度不典型增生3例(10.0%)。以上标本均经4%甲醛固定后常规制作石蜡包埋切片,切片厚4 μ m。

1.2 主要试剂

兔抗人PUMA多克隆抗体及鼠抗人C-myb单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司;EnVisionTM染色试剂盒购自瑞士DAKO公司。

1.3 方法

PUMA和C-myb染色方法均为免疫组化二步法,按试剂盒说明书操作。

免疫组化评分按二级计分法,首先按染色强度评分:无色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分;然后按阳性细胞率评分:肿瘤细胞内无阳性染色者为0分,阳性细胞率≤10%为1分,11%-50%为2分,51%-75%为3分,＞75%为4分,将二者相加得综合免疫组化评分。

1.4 统计学处理

将所有实验数据输入SPSS13.0统计软件包,PUMA或C-myb表达阳性率与组织学或临床因素的相互关系应用 χ2检验或Fisher's精确概率法;两者评分之间比较用t检验;三者评分之间比较用F检验。检验水准以P＜0.05被认为有显著意义。

2 结果

2.1 结肠癌和癌旁组织的PUMA和C-myb表达情况

PUMA免疫组化阳性产物主要定位于细胞膜和细胞浆(图1,2);C-myb免疫组化阳性产物主要定位于细胞核,偶见定位于胞浆(图3,4)。54例结肠腺癌PUMA和 C-my表达阳性病例分别为 35例(64.8%)和32例(59.3%),其评分值分别为2.38±1.42和2.21±1.74;30例癌旁组织PUMA和C-my表达阳性病例分别为5例(16.7%)和4例(13.3%),其评分值分别为0.48±0.69和0.46±0.74;结肠癌PUMA和C-my表达阳性率及其评分明显高于癌旁组织(PUMA:χ2=17.92,t=7.04,P=0.000;C-myb:χ2=16.61,t=5.30,P=0.000)。PUMA和(或)C-myb表达阳性的癌旁组织呈轻至重度不典型增生。

2.2 PUMA和C-myb表达与结肠癌临床病理特征的关系

淋巴结未转移及未侵犯浆膜层及Dukes分期A+B病例PUMA和C-myb表达阳性率及其评分明显低于低分化腺癌、淋巴结转移及侵犯浆膜层及Dukes分期C+D病例,均有显著或高度显著性差异(P＜0.05或P＜0.01);高分化腺癌PUMA表达阳性率及其评分明显低于低分化腺癌(P＜0.05);PUMA和C-myb表达与结肠癌患者年龄、性别、部位及肿块大小无明显关系(P＞0.05),见表1。

图1 PUMA阳性表达,评分4分,高分化腺癌,免疫组织化学×200

图2 PUMA阳性表达,评分3分,轻度不典型增生的癌旁组织,免疫组织化学×200

图3 C-myb阳性表达,评分5分,低分化腺癌,免疫组织化学×200

图4 C-myb阳性表达,评分3分,中度不典型增生的癌旁组织,免疫组织化学×200

2.3 PUMA和C-myb在结肠癌中表达的相互关系

35例PUMA表达阳性病例中C-myb阳性表达28例,19例PUMA表达阴性病例中C-myb表达阴性15例,两者表达呈明显一致性(χ2=17.72,P=0.000);PUMA和C-my评分值之间呈高度正相关(r=0.59,P=0.000)。

3 讨论

PUMA基因定位于19q,其cDNA长119 kb,它编码一个193个氨基酸的蛋白质,它包含一个Bcl-2同源结构域(BH3),这个结构域在Bcl-2家族中的许多凋亡因子中都存在,除BH3结构域外不存在其他与已知蛋白同源的区域,缺失BH3结构域的PUMA不具备促凋亡作用。PUMA不但对正常细胞诱导凋亡,对肿瘤细胞也有重要作用,体外实验证实PUMA能强烈诱导肺癌和食管癌细胞凋亡,抑制头颈肿瘤细胞系的生长和集落形成能力,裸鼠移植瘤实验证实PUMA能抑制肿瘤生长的作用[3]。

表1 PUMA和C-my表达评分与结肠癌临床病理特征的关系

C-myb是一种核内癌基因,位于人类6号染色体长臂24区带,其编码的蛋白质为80 kd。早在80年代末国外学者发现C-myb在细胞增殖分化过程中起着十分重要作用。近年研究发现C-myb在许多恶性肿瘤组织中(乳腺癌,直肠腺癌,肝细胞癌,食道腺癌,宫颈癌,头颈鳞癌等)高表达,而其来源的正常组织或良性病变低表达或不表达;高表达的恶性肿瘤多分化差、进展快、易发生转移或复发、侵袭能力强及预后差[4-7];且应用C-myb反义寡核苷酸可抑制一些恶性肿瘤的进展、转移及侵袭能力[5,7]。

国内外关于结肠良恶性病变组织中PUMA和C-myb表达研究的文献报道极少。本组资料显示,结肠癌PUMA和C-myb表达阳性率及其评分均明显高于癌旁组织(P＜0.01);PUMA和(或)C-myb阳性表达的良性病变结肠上皮呈中度至重度不典型增生。淋巴结未转移、未侵犯浆膜或浆膜外组织器官及Dukes分期A+B病例PUMA和C-myb表达阳性率及其评分明显低于淋巴结转移、侵犯浆膜或浆膜外周围组织及Dukes分期C+D病例(P＜0.05或P＜0.01);高分化腺癌PUMA表达阳性率及其评分明显低于低分化腺癌(P＜0.05);结肠癌中PUMA和C-myb表达水平呈正相关(r=0.59,P=0.000)。结果提示PUMA和C-myb表达水平可能是反映结肠腺癌发生、进展及临床生物学行为的重要标记物,其阳性表达者进展快,易发生转移,侵袭能力强。检测结肠良性病变组织中PUMA和(或)C-myb表达水平对预防和早期发现结肠腺癌可能有较重要的临床意义。此外,本组资料显示,在结肠腺癌中PUMA和C-myb表达水平呈一致性及两者评分值之间呈高度正相关,说明两者之间存在着密切的内在关系,其机制仍需更深入研究。

[1]Yee KS,Wikinson S,James J,et al.PUMA-and Bax-induced autophagy contributes to apoptosis[J].Cell Death Differ,2009,16(8):1135.

[2]Sinicrope FA,Rego RL,Okumura K,et al.Prognostic impact of bin,puma,and noxa expression in human colon carcinomas[J].Clin Cancer Res,2008,14(18):5810.

[3]Diallo JS,Aldejmah A,Mouhim AF,Et al.NoXA and PUMA expression add to clinical markers in predicting biochemical recurrence of prostate cancer patients in a survival tree model[J].Clin Cancer Res,2007,13(23):7044.

[4]RansayRG,Gonda TJ.MYB function in normal and cancer cells[J].Nat Rev Cancer,2008,8(7):523.

[5]Gonda TJ,Leo P,Ramsay RG.Estrogen and MYB in breast cancer.:potential for new therapies[J].Expert Opin Biol Ther,2008,8(6):713.

[6]Wilkins HR,Doucet K,Duke V,et al.Estrogen prevents sustained COLO-205 human colon cancer cell growth by inducing apoptosis,decreasing C-myb protein,and decreasing transcription of the anti-apoptosis protein bcl-2[J].Tumor Biol,2010,31(1):16.

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