刘 彤,李 哲,毕晓颖

(1.吉林大学白求恩医学院 细胞生物学教研室,吉林长春130021;2.吉林大学公共卫生学院卫生毒理学教研室)

线粒体是细胞的重要细胞器,它在细胞能量代谢、自由基生成、蛋白质磷酸化,尤其是在细胞凋亡过程中起核心调控作用[1]。Science于1999年发表了“Mitochondrial make a comeback”专题系列论文[2],重申线粒体再度成为当今生命科学和分子医学中的热点和前沿。线粒体功能缺陷可引起神经肌肉疾病、心血管病、糖尿病、帕金森氏病和肿瘤学等多种疾病,分离线粒体对于我们理解线粒体功能障碍与相关疾病的机制有重要作用。但是,针对新生大鼠脑组织中线粒体的分离和特性分析的描述还不全面。因此,本实验的目的就是建立一个方法,用来快速的对新生大鼠脑组织中的线粒体进行分离,并为其特性分析奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 新生大鼠6只、超速离心机、电子显微镜、天平、动物手术器械、匀浆器

1.2 试剂 0.25M蔗糖、0.5 mM K+-EDTA、10 mM Tris-HCl、10mg/ml牛的血清白蛋白、用线粒体缓冲液稀释的浓度分别为12%、26%、40%的Percoll、2.5%戊二醛、2%四氧化锇、乙醇、丙烯氧化物、树脂。

1.3 方法

1.3.1 线粒体的分离

(1)迅速摘取新生大鼠的脑,称重400-500 mg,移入冰冷的线粒体分离缓冲液(0.25 M蔗糖,0.5 mM K+-EDTA 10mM Tris-HCl,pH=7.4)中 ,在实验过程中所有的仪器和缓冲液都要保持冰冷(4℃),每个脑都分离出左右半球,并保证每个样品中都含有左右脑组织。

(2)每个样品在3.6 ml 12%的Percoll中搅匀,用直径为0.12 mm的匀浆器搅拌10次,再用直径为0.06 mm的匀浆器搅拌10次。

(3)在离心管中先铺一层1.2 ml 40%的Percoll,再铺一层1.2 ml 26%的Percoll,然后取上述搅拌好的样品1.2 ml铺在最上层。……