刘 彤,李 哲,毕晓颖

(1.吉林大学白求恩医学院 细胞生物学教研室,吉林长春130021;2.吉林大学公共卫生学院卫生毒理学教研室)

线粒体是细胞的重要细胞器,它在细胞能量代谢、自由基生成、蛋白质磷酸化,尤其是在细胞凋亡过程中起核心调控作用[1]。Science于1999年发表了“Mitochondrial make a comeback”专题系列论文[2],重申线粒体再度成为当今生命科学和分子医学中的热点和前沿。线粒体功能缺陷可引起神经肌肉疾病、心血管病、糖尿病、帕金森氏病和肿瘤学等多种疾病,分离线粒体对于我们理解线粒体功能障碍与相关疾病的机制有重要作用。但是,针对新生大鼠脑组织中线粒体的分离和特性分析的描述还不全面。因此,本实验的目的就是建立一个方法,用来快速的对新生大鼠脑组织中的线粒体进行分离,并为其特性分析奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 新生大鼠6只、超速离心机、电子显微镜、天平、动物手术器械、匀浆器

1.2 试剂 0.25M蔗糖、0.5 mM K+-EDTA、10 mM Tris-HCl、10mg/ml牛的血清白蛋白、用线粒体缓冲液稀释的浓度分别为12%、26%、40%的Percoll、2.5%戊二醛、2%四氧化锇、乙醇、丙烯氧化物、树脂。

1.3 方法

1.3.1 线粒体的分离

(1)迅速摘取新生大鼠的脑,称重400-500 mg,移入冰冷的线粒体分离缓冲液(0.25 M蔗糖,0.5 mM K+-EDTA 10mM Tris-HCl,pH=7.4)中 ,在实验过程中所有的仪器和缓冲液都要保持冰冷(4℃),每个脑都分离出左右半球,并保证每个样品中都含有左右脑组织。

(2)每个样品在3.6 ml 12%的Percoll中搅匀,用直径为0.12 mm的匀浆器搅拌10次,再用直径为0.06 mm的匀浆器搅拌10次。

(3)在离心管中先铺一层1.2 ml 40%的Percoll,再铺一层1.2 ml 26%的Percoll,然后取上述搅拌好的样品1.2 ml铺在最上层。

(4)将离心管超速离心19 000转5分钟,弃去上清,取中层液体并将其1∶4稀释在线粒体缓冲液中,再超速离心14 000转10分钟,将沉淀稀释在1 ml线粒体缓冲液中,超速离心14 000转5分钟,最后将沉淀溶于100微升线粒体缓冲液中。

1.3.2 线粒体的电镜观察

(1)将管中一二三层的液体都固定在2.5%的戊二醛中,每个样品用0.1 M的磷酸盐缓冲液(150 mM磷酸氢二钠,100mM氢氧化钠,PH7.4)洗三次共十分钟,然后在2%四氧化锇中固定1小时。

(2)每个样品再用0.1M的磷酸盐缓冲液洗三次 ,在浓度分别为 25%、50%、85%、95%、100%的乙醇溶液中脱水十分钟。

(3)每个样品再在丙烯氧化物中深度脱水十分钟,然后在1∶1的丙烯氧化物和树脂混和物中渗透两小时,然后在1:2的丙烯氧化物和树脂混和物中过夜。

(4)最后将样品包埋入树脂中70℃过夜,电镜观察线粒体。

2 结果

2.1 线粒体的分离

Percoll密度梯度离心提供获得高纯度脑组织线粒体的最佳方法,Percoll密度梯度中的三种浓度的电镜照片见图1。在此研究中改变Percoll密度梯度条件可影响线立体的分离纯度和产率。中层Percoll浓度在20%-24%时,超速离心后可以看见在中层(26%)和底层(40%)之间有一条很浅的带。电子显微镜下观察这一条带含有除线立体外的其他细胞成分。在中层使用26%的Percoll可以去除这一层并使中层得到产率更高的线粒体。

2.2 线粒体的电镜观察

分离第二层线粒体超微结构见图2。利用上述方法分离出新生大鼠脑组织中的线粒体,电镜观察线粒体的超微结构形态具有完整的线粒体外膜和发育良好的线粒体嵴,线粒体的密度很高且形状不同,呈球形和椭圆形。在所有的线粒体样品中,中层Percoll浓度在20%-24%时,观察发现约有90%为线粒体。

图1 不同浓度Percoll的线粒体分离图

图2 线粒体超微结构

3 讨论

线粒体是许多重金属毒作用的靶细胞器,研究线粒体功能的改变对于探讨重金属对神经系统的损伤作用机制具有重要的意义。许多研究者已经报道了从成人脑组织分离线粒体的不同方法,但是对新生儿脑组织中的线粒体分离方法却描述甚少。

最初,我们曾用Ficoll梯度来分离线粒体,线粒体纯度较低,后来,我们改用Percoll密度梯度离心法从新生脑组织中分离线粒体,结果获得了高纯度和产率的线粒体。本实验从新生大鼠脑组织中分离线粒体,并对其特性做出了详尽的分析和阐述。使用Percoll梯度法来分离新生大鼠脑组织中的线粒体是一种快速有效的方法[3-5],它可以得到纯度和产率较高的线粒体。并通过电子显微镜对新生大鼠脑组织中的线粒体进行形态观察得以验证。

在成年大鼠脑组织线粒体的制备中,大多数线粒体沉淀在了第三层(Percoll26%-40%)。在新生大鼠脑组织线粒体的制备中,使用相同的密度梯度离心,大多数线粒体沉淀在了第二层(Percoll12%-26%)。这个不同之处可能是因为沉淀系数不同以及成年大鼠和新生大鼠线粒体中细胞成分的密度不同所致。调整中层 Percoll的浓度,调为20%-24%,结果发现在第三层中的线粒体增多,而这一层含有除线粒体以外的其他细胞成分。本实验显示成年大鼠和新生大鼠脑组织中的线粒体有明显的不同。

从新生大鼠脑组织中分离出的线粒体在电子显微镜下观察发现其大小和形状并不相同。绝大多数的线粒体很小(0.5-1微米),形状有椭圆形和球形。此形态与成年大鼠脑组织中的线粒体的表现一致。但一些线粒体被破坏了,能够看见其形态但是缺乏线粒体嵴。如果在脑组织搅拌过程中减少搅拌次数可以降低线粒体的破坏率,但是细胞破裂不完全使细胞沉淀在第二层。

综上所述,这些结果显示使用Percoll密度梯度离心的方法可以成功地从新生大鼠脑组织中分离出线粒体,为新生大鼠脑组织中线粒体功能研究提供一个实用的模型。

[1]Cassarino DS,Bennett JP.An evaluation of the role of mitochondria in neurodegenerative diseases:mitochondrial mutations and oxidative pathology,protective nuclear responses,and cell death in neurodegeneration,Brain Res[J].Brain Res Rev,1999,(29):1.

[2]Kibertis PA.Mitochondrial makes a comeback[J].Science,1999,283:1475.

[3]Truscott KN,Fanner NP.Import of carrier proteins into mitochondria[J].Biol Chem,1999,380:1151.

[4]Sims NR,Anderson MF.Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation[J].Nat Protoc,2008,3(7):1228.

[5]Dunkley PR,Jarvie PE,Robinson PJ.A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes[J].Nat Protoc,2008,3(11):1718.