陈永敢，陈光宙，袁学军，陈忠荫，林应耀，林炽贤

（琼州学院生物科学与技术学院，海南 三亚 572022）

灵芝 （Ganoderma spp.）是一种腐生型的真菌，以腐解木材中的木质素作为生长发育的营养基础。经典分类学研究认为，灵芝隶属担子菌门中的担子菌纲 （Basidiomycetes）、 伞菌亚纲 （Agaricomycetidae）、 多孔菌目（Polyporales）、 灵 芝菌科 （Ganodermataceae）、 灵 芝 属（Ganoderma）[1]。自古以来，灵芝就被认为是滋补强壮的珍贵药材，我国古代著名的医学著作 《本草纲目》等就对其进行了详细的记载[2，3]。随着近代生物化学技术的发展，新的研究方法逐渐地运用到灵芝功效研究中来，分析证明了灵芝中含有丰富的营养化学成分，且不同的物质具有不同的临床功效，最常见的有高分子多糖、三萜化合物、有机锗、氨基酸、生物碱、蛋白酶及多种肽等，其中功能最显著且研究最深入的是高分子多糖[4，5]。

通过热水、CO2超临界萃取技术，从灵芝中提取出来50多种高分子多糖[6]，这些多糖能抑制增生细胞的形成，具有明显的免疫调节作用，可以想见在肿瘤生物学和病毒侵染等研究中这类化合物将发挥越来越重要的作用[7]。有研究表明，赤芝多糖有明显的强心降压作用，对动脉粥样硬化有预防和治疗作用；灵芝子实体提取出2种聚糖（Ganoderan A、Ganoderan B），经腹腔注入正常小鼠，均能降低血糖[8]。总之，随着生物化学及分析化学技术的发展，灵芝的功效将会越来越多的被揭示出来，同时其应用前景将更加的广泛。

近年来灵芝 （Ganoderma spp.）的人工栽培已有所推广，特别是赤芝 （Ganoderma lucidum）的栽培技术已成熟，但人工栽培所必需的制种过程中，灵芝多糖含量变化的研究至今鲜有报道。本研究选取了4株具有重要药用价值的灵芝，进行栽培制种并研究其多糖含量的变化，对进一步研究人工栽培灵芝药用价值具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及灵芝的制种

供试菌株：Ganoderma atrum Hz2、Ganoderma lucidum Hz5、 Ganoderma neojaponicum Wzs1、 Ganoderma sinense Hz1四株菌株均为本研究室保存。

灵芝制种：灵芝菌丝接种于PDA培养基表面，于28℃恒温培养至长出菌落，21 d后形成一级成熟菌丝。将一级成熟菌丝接种到二级培养基 （木屑78%、麦麸20%、蔗糖1%、石膏1%、水，121℃、0.1 MPa灭菌2 h）上，28℃恒温避光培养30 d得二级成熟菌丝；将二级成熟菌丝接种到三级培养基 （木屑73%、玉米粉5%、麦麸20%、蔗糖1%、石膏1%，121℃、0.1 MPa灭菌2 h）上，28℃恒温避光培养50 d得三级成熟菌丝。

1.2 灵芝菌丝多糖待测液的制备

已培养成熟的灵芝菌丝65℃恒温烘干，取0.2 g研磨粉碎并移至试管，加入15 mL 95%的酒精，密闭状态下78℃水浴 30 min， 3 000 r·min－1离心 30 min， 去除上清，重复2次。取沉淀加入15 mL蒸馏水，密闭状态下沸水浴1 h， 3 000 r·min－1离心 30 min。 收集上清并定容至 100 mL（菌株 Ganoderma neojaponicum Wzs1定容至 50 mL），摇匀得一级菌丝多糖待测液。二级菌丝上清液定容至50 mL（菌株Ganoderma lucidum Hz5定容至25 mL）、三级菌丝上清液均定容至25 mL，其它提取操作步骤与一级菌丝相同。

1.3 灵芝菌丝多糖含量的测定

适量葡萄糖105℃烘干并取0.5 g，蒸馏水溶解并定容至 50 mL， 从中取出 1 mL 定容至 50 mL， 得到 200 μg·mL－1的葡萄糖溶液，按表1制备葡萄糖标准溶液。0.1 g蒽酮溶于106 mL硫酸溶液中 （硫酸溶液的配制为76 mL浓硫酸加30 mL水）。按表1取葡萄糖溶液和蒸馏水，加入5 mL蒽酮试剂摇匀，沸水浴10 min，再冰水浴10 min，625 nm处测定吸光值。取菌丝多糖待测液1 mL，加入蒽酮试剂5 mL，沸水浴10 min，之后冰水浴10 min，取出于625 nm处测定菌丝多糖溶液的吸光度。葡萄糖标准溶液的制备见表1。

表1 葡萄糖标准溶液的制备

2 结果

2.1 灵芝的制种

将保存的菌株接种到一级培养基上培养21 d后，菌丝完全覆盖培养基表面，菌丝纯白、粗壮、致密，菌落中间略泛黄、，将菌丝转接到二级种培养基，另挑取部分菌丝进行烘干处理。菌丝在二级培养基上培养30 d菌丝长满瓶，瓶盖处菌丝厚实、纯白。培养成熟的二级菌丝转接到三级培养基，并挑取部分菌丝进行烘干处理。菌丝在三级培养基上培养50 d长满瓶，菌丝粗壮、密集、分布均匀，挑取成熟菌丝进行烘干处理，见图1。

2.2 制种过程中多糖含量的变化

以蒸馏水为空白，葡萄糖浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得到葡萄糖标准曲线回归方程为：

注：A表示吸光值，C表示葡萄糖浓度。

利用蒽酮－硫酸显色法在波长为625 nm处，测得4株不同级种的灵芝菌丝吸光值在0.2～0.4之间。制种过程中灵芝菌丝多糖含量变化见图2。

Hz2、Hz5、Hz1株灵芝真菌在制种过程中多糖含量呈递减的趋势，其中菌株Ganoderma neojaponicum Wzs1较特殊，二级种在制种过程中多糖含量最多为1.75%。在制种的最初阶段一级种时，4株灵芝真菌中Ganoderma sinense Hz1多糖含量最大为3.18%，而菌株Ganoderma neojaponicum Wzs1最少为1.05%；处于完成制种的三级种阶段，菌株Ganoderma lucidum Hz5多糖含量最少为0.56%，而菌株 Ganoderma atrum Hz2最大为 0.88%。

3 讨论

灵芝真菌制种过程中，一级菌丝到三级菌丝多糖含量总体上呈递减趋势，其中一级菌丝到二级菌丝多糖含量的变化较大，二级菌丝到三级菌丝的多糖含量变化较小。一级PDA培养基主要成分为马铃薯、葡萄糖，而二级培养基与三级培养基相似，主要成分为木屑，这种成分上的差别可能造成了灵芝制种过程中多糖含量的递减。二级与三级培养基含糖量较少，不利于菌丝对营养成分的吸收，同时菌丝在生长过程中消耗了菌体内储存的糖类物质，因此在制种完成阶段多糖的含量就比制种之初发生了减少[9]。菌株Ganoderma neojaponicum Wzs1分离自海南五指山，制种过程中各级菌丝多糖含量并未呈逐级递减的规律性变化，二级种的含糖量明显偏高，这种特殊性是产自五指山地区灵芝所具有的特点，还是Ganoderma neojaponicum本身具备的特征，有待进一步的研究。

一级菌丝 Ganoderma atrum Hz2、Ganoderma sinense Hz1多糖含量较高，而Ganoderma lucidum Hz5多糖含量较低，这可能因为前两株灵芝菌丝都从野生子实体中分离出来的，未经人工驯化保持了天然的多糖含量，而Hz5已经经过人工驯化。人工栽培的条件下，部分天然的糖分会有所丢失，所以Hz5一级菌丝多糖含量比菌株Hz2和Hz1的一级菌丝的多糖含量少[10]。在制种完成的三级种阶段，4株菌株的多糖含量只有较小的差别，但菌株Hz5菌丝的多糖含量较少。因此，完成人工制种的紫芝和黑芝比赤芝的药用价值高，实现这两种灵芝的人工栽培将有利于进一步推广高品质和高药用价值的灵芝。

[1]戴玉成.中国多孔菌名录[J].菌物学报，2009，28(3)：315-327.

[2]Chang ST,Buswell JA.Mushroom nutriceuticals[J].World J Microb Biotechnol,1996(12):473-476.

[3]Zhang M,Cui SW,Cheung PCK,et al.Antitumor polysaccharides from mushrooms:a review on their isolation process,structural characteristics and antitumor activity[J].Trends Food Sci Tech,2007(18):4-19.

[4]Paterson R.Ganoderma-A therapeutic fungal biofactory[J].Phyto chemistry,2006(67)：1985-2001.

[5]Tseng YH,Yang JH,Mau JL.Antioxidant properties of polysaccharides from Ganoderma tsugae[J].Food Chem,2008(107)：732-738.

[6]Jong SC,Birmingham JM.Medicinal benefits of the mushroom Ganoderma[J].Adv.Appl.Microb.,1992(37):101-134.

[7]Zhu XL,Chen AF,Lin ZB.Ganoderma lucidum polysaccharides enhance the function of immunological effector cells in immunosuppressed mice[J].J Ethnopharmacol,2007(111):219-226.

[8]Moncalvo JM,Buchanan PK.Molecular evidence for long distance dispersal across the Southern Hemisphere in the Ganoderma applanatum-australe species complex(Basidiomycota)[J].Mycol Res,2008(112):425-436.

[9]Smith JE,Rowan NJ,Sullivan R.Medicinal mushrooms:a rapidly developing area of biotechnology for cancer therapy and other bioactivities[J].Biotechnol Let,2002(24):1839-1845.

[10]Aida FMNA,Shuhaimi M,Yazidb M,et al.Mushroom as a potential source of prebiotics:a review[J].Trends Food Sci Technol,2009(20):567-575.