邹 晓，瞿娇娇，刘清兴，刘爱英

（贵州大学生命科学学院，真菌资源研究所，贵阳 花溪 550025）

关于微生物对烟叶醇化的影响，Koller最早进行了添加微生物以提高雪茄烟香气和吃味的尝试[1]。通过在雪茄烟中添加酵母菌可加速发酵进行，但同时也会促进细菌和霉菌生长。Tamayo AI等发现，用微生物接种的烟叶，香气和性状均得到改善，尤其是当采用微球菌属 （Micrococcus）或杆菌属 （Bacillus）或两者的混合物接种烟叶时，效果更为显著[2]。在国内，陈福星等用从烤烟烟叶上分离鉴定的4个优势菌种 （均属芽孢杆菌科的细菌）处理烟叶后不仅大大缩短了发酵时间，而且使烟叶品质及色香味均有一定的提高[3]。韩锦峰等将由烤烟叶面分离筛选的芽孢杆菌属 （Bacillus）和梭状芽孢杆菌属 （Clostridium）优势菌种，混合配制成生物制剂 （TFA）用于烟叶发酵，结果表明，TFA可加速烤烟发酵，提高烟叶品质，并且具有抑制烟叶霉变的作用[4]。谢和等施加微生物的烟叶发酵后，青杂气减少，刺激性有所降低，香味略有增加，余味舒适[5]。

关于微生物对烟叶的醇化研究，除了一些利用酵母改善烟草品质影响的研究外，关于丝状真菌改善烟叶质量的研究不多[5]。食用菌是一类含有丰富酶系的丝状真菌，特别是其中的木素酶可对烟叶中的木质素有较好的降解效果[6]，通常烟叶中的木质素热解会产生一些影响吸味并且致癌的物质[7]。利用食用菌来定向改善烟叶品质、减害、缩短醇化时间是本次试验的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

白平菇P339（Pleurotus ostreatus），编号：Z-3；黄伞(Pholiota adipose)，编号：Z-4；糙皮侧耳 （Pleurotus ostreatus）， 编号：Z-6； 珠星平菇 （Pleurotus ostreatus）， 编号：Z－7； 苏香菌 （Lentinula edodes）编号： Z－15； 啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）， 编号 Z－8； 面包酵母 （Saccharomyces cerevisiae），编号：Z－9。以上菌株现保存于贵州大学真菌资源研究所。

1.1.2 烟叶

品种云85，等级B3F，来自贵州省烟草公司福泉基地。

1.1.3 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g（切块，沸水煮30 min，4层纱布过滤取汁）、葡萄糖20 g、琼脂 20 g，水1 000 mL，pH自然，121℃灭菌30 min。加琼脂20 g即为固体培养基，用于培养食用菌。

麦芽汁培养基：麦芽汁 1 000 mL，波美度 5.5，pH 6.5，118℃灭菌20 min。加琼脂20 g即为固体培养基，用于培养酵母菌。

1.2 方法

1.2.1 烟叶处理

将烟叶去掉主叶脉分为两半，一半用于接种微生物，另一半做对照。每15片烟叶接1个菌种。放入培养食用菌的塑料袋中封口并加压蒸汽灭菌，110℃灭菌20 min。

1.2.2 菌悬液的制备

取20个50 mL三角瓶装15粒左右玻璃珠，加入自来水30 mL，灭菌。灭15个空食用菌塑料袋，以便接种后盛装烟叶进行发酵。10支毛笔灭菌后，用于接种。灭1 mL型移液枪头1盒。灭菌参数118℃、30 min，待上述菌种斜面培养1个星期后观察生长情况，选取生长情况较好的菌种制成菌悬液。取适量无菌水加入相应的试管，冲洗，振荡，然后倒入50 mL三角瓶中在摇床上振荡40 min。 参数 26℃， 150 r·min－1。

1.2.3 接种

超净工作台上，将食用菌塑料袋中灭菌的烟叶取出，用毛笔醮菌悬液均匀涂抹于烟叶表面。将接种后的烟叶放回无菌的食用菌塑料袋中。对照烟叶用无菌水代替菌悬液，其它处理相同。温度30℃、空气湿度 (70±2)%发酵培养 50 d。

1.2.4 测试方法

烟叶理化分析参见王瑞新[9，10]；烟叶评吸由贵州中烟公司技术中心组织进行。

2 结果与分析

2.1 烟叶蒸汽灭菌后的颜色和香味变化

烟叶灭菌后颜色及香味变化情况，见表1、表2。

表1 烟叶灭菌后颜色变化情况

表2 灭菌后烟叶香味增加程度

烟叶灭菌后颜色随着灭菌时间和温度增加呈现出颜色逐渐情况，由最初的榴萼黄到栗棕色。其原因是在烟叶灭菌和灭酶的过程中，氨基酸和葡萄糖聚合发生了美拉德反应，形成了具有颜色的类黑精，使得烟叶的颜色发生了变化。从表1中也可以看到，若保持烟叶颜色不变化则灭菌温度不能超过100℃，时间不宜超过15 min。灭菌后除了颜色发生变化，灭菌烟叶的嗅觉香味也发生明显变化，其趋势变化与颜色变化一致。Nishi OA等曾用美拉德反应得到的棕化产物处理卷烟使香味增强，烟气协调醇和，刺激性减小[11]。Wu DL等也通过梅拉德反应结合增效剂，研制成新型烟用增香剂[12]。

2.2 烟叶发酵后的理化检测结果

烟叶发酵后理化分析检测结果见表3。

表3 烟叶发酵后理化分析检测结果

烟叶经过发酵后烟碱的含量比空白对照略有提高，增加幅度最大为Z－10，其水溶性总糖也降低最多，该菌株为啤酒酵母，酵母本身适合生产生物碱，其生物碱的累积增加了对烟碱测定的干扰。烟碱增加说明了微生物活动确实会影响烟叶的理化性质。另一株值得关注是Z－7菌株，对烟叶的烟碱和总氮影响不大，但是对水溶性总糖提高明显对烟叶理化指标改善明显。另外经过微生物处理后的烟叶，会形成比较有特点的烟叶，糖/碱和氮/碱变化较大。

2.3 烟叶发酵后的评吸结果

接种真菌发酵后烟叶评吸分值情况见表4。

检测烟叶醇化状态，其中很重要的手段就是对烟叶进行人工评吸。根据表4可以看出趋势，食用菌处理的样品在香气 （质、量）、吃味、刺激性上比对照都有所改善。改善效果最明显是Z－7菌株，其得分最高综合评价也最好，结合表3结果Z－7菌株对水溶性多糖提高明显，该菌株可以进一步开发。食用菌发酵烟叶另一个明显的效果就是对烟叶杂气的去除，表4中的Z-6菌株、Z-7菌株、Z-15菌株相比于对照和灭菌对照烟叶杂气都有不同程度的减少。由于烟叶经过灭菌处理其颜色上距离工业生产要求较大，未给外观评价打分，致使评吸总得分不高，但所用菌株对烟叶质量改善已经很明显。

表4 接种真菌发酵后烟叶评吸分值表

3 讨论

能够对烟叶增香的湿热灭菌值得关注，由于非酶褐变反应产生了许多有香味的化学物质，可在一定程度改善初烤烟叶品质。香气物质的主要来源为糖类物质在高温条件下与氨基酸反应生成的。但在此过程中需注意烟叶颜色等外观指标，外观颜色和内在品质之间需要找到一个平衡点。如果不考虑烟叶外观，高压、湿热蒸汽处理烟叶，对改善烟叶内在品质效果明显。

关于微生物醇化烟叶的研究很多，Reid等在研究雪茄烟发酵过程时发现，微生物的活动比较活跃，与发酵强度和发酵质量有一定关系，并发现了一些烟叶醇化过程中的微生物[13]。后来的一些报道大都集中在从烟叶本身分离微生物，包括酵母、丝状真菌、细菌等[14]。我国有悠久微生物应用的历史，可供选择的微生物很多，因此开发新的微生物资源用于烟草醇化工业很有前景。文中也发现了1株Z-7的食用菌菌株取得较好的评吸效果，如果扩大筛选资源会发现更多的醇化资源。利用这些微生物资源要以安全和有特色为主，如降害、增香等特色微生物。在烟叶醇化的环境下 （温度35℃左右，RH＜75%），对合适的微生物进行育种筛选也是必要的。

文中结果显示，平菇 Pleurotus ostrea的一株菌有较好的醇化效果，但在降害方面效果不够显著。因此研究各种微生物如何协调统一发酵烟叶也是应用研究的好思路，简单的几株菌就可能组合出很有特色的配方。而烟叶的自然醇化又是一个涉及生物、化学、环境等多种因素协同作用的结果。存放的环境条件和所存放的烟叶种类决定了烟叶上微生物的丰度和种类及其演化过程，而这些微生物的代谢和演化活动很大程度上决定了烟叶的醇化品质。从自然醇化好的烟叶发现新的微生物资源，特别是一些丝状真菌资源仍将是一个有前景的研究方面。

[1]Koller JBC.Der tabak in naturwissenschaf-tlicher[J].Landwirt Schaftlicher and Technischer Beziehung,1858.

[2]Tamayo AI,Cancho FG.Microbiology of the fermentation of Spanishtobaccos[J].International Congress of Microbiology,1953(6):48-50.

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[4]韩锦峰，朱大恒.陈化发酵期间烤烟叶面微生物活性及其应用研究[J].中国烟草科学，1997(4)：13-14.

[5]谢和，韩忠礼.微生物发酵对烤烟内在品质的影响[J].山地农业生物学，1999，18(4)：227-230.

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