张 帆，王淑敏

（长春中医药大学，吉林 长春 130117）

大马勃Calvatia gigantean(Batsch ex Pers)Lloyd为中药马勃的来源之一，具有止血、解毒、清肺、消肿、利喉等功效，可治疗咳嗽、咽喉肿痛、扁桃体炎、外伤出血。由于野生资源不足，为扩大药源，本实验拟通过对大马勃摇瓶发酵培养基进行初步研究，为液体深层发酵工艺研究以及规范化、工厂化生产提供理论依据[1]。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

大马勃Calvatia gigantean(Batsch ex Pers)Lloyd斜面菌种，由长春中医药大学药用真菌研究所提供。

1.2 药品和试剂

葡萄糖、蔗糖、木糖、乳糖、蛋白胨、酵母粉、尿素、硫酸铵、硝酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、碳酸钙、磷酸二氢钠、维生素VB1、3,5-二硝基水杨酸试剂 （DNS）、盐酸、氢氧化钠，以上均为分析纯，麦麸、豆饼粉、玉米粉。

1.3 试验仪器

HYG-III迴转式恒温调速摇瓶柜 （上海新星自动化控制设备成套厂）；721紫外可见分光光度计 （上海第三分析仪器厂）；101-1A型数显电热鼓风干燥箱 （上海沪南科学仪器联营厂）；超净工作台 （苏州净化设备厂）；YXQGO-280手提式高压蒸汽消毒器 （丹东市日用五金厂）。

1.4 试验方法

1.4.1 菌种培养及指标测定

斜面菌种活化后，在无菌条件下，接入250 mL三角瓶 （培养基装量100 mL）中，接种量为10%，在摇瓶机中培养，培养温度为25℃，转速为150 r·min-1，摇瓶培养16 d，取出，过滤，将菌球烘干并称其重量，发酵液则通过3,5-二硝基水杨酸法测定其中多糖的含量。

1.4.2 碳源选择试验

以马铃薯汁20%、蛋白胨2%、KH2PO40.15%、MgSO40.10% （pH自然）作为基础培养基，碳源分别为空白、葡萄糖3%、蔗糖3%、玉米粉汁5%、乳糖3%、麦芽糖3%。每种培养基平行做3次，进行指标测定。

1.4.3 氮源选择试验

以马铃薯汁 20%、蔗糖3%、KH2PO40.15%、MgSO40.10% （pH自然）作为基础培养基，氮源分别为空白、蛋白胨2%、酵母膏0.5%、豆饼粉汁5%、黄豆粉汁3%、硝酸铵0.2%、麦麸汁5%、硫酸铵0.2%、牛粪汁5%，每种培养基平行做3次，进行指标测定。

1.4.4 微量元素选择试验

以马铃薯汁20%、蔗糖3%、酵母膏0.5% （pH自然）作为基础培养基，微量元素分别为空白；KH2PO40.15%；MgSO40.10%； KH2PO40.15%、 MgSO40.10%； CaO 0.1%、KH2PO40.15% 、 VB10.02% ； NaH2SO40.15% 、 KH2PO40.15%、 VB10.02%； VB10.02%。 每种培养基平行做 3次，进行指标测定。

1.4.5 不同营养元素正交试验

正交试验设计见表1。

表1 正交试验因素与水平表

以马铃薯20% （pH自然）为基础培养基，根据上述试验选择的最佳碳源、氮源、微量元素进行设计，采用L9(34)正交试验，对结果进行统计分析确定碳氮源及微量元素的最佳浓度组合。

1.4.6 发酵初始pH选择试验

以马铃薯汁20%、蔗糖3%、酵母膏 0.5%、MgSO40.1%、KH2PO40.15% （pH自然）作为基础培养基， 将初始 pH 值调至 4、 4.5、 5.0、 5.5、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0、8.5、9.0。每种培养基平行做3个，进行指标测定。

1.4.7 不同培养温度选择试验

以马铃薯汁20%、蔗糖3%、酵母膏 0.5%、MgSO40.1%、KH2PO40.15% （pH自然）作为基础培养基， 将液体培养基分别置于15℃、20℃、25℃、28℃、30℃下培养。每种培养基平行做3个，进行指标测定。

1.4.8 不同接种量选择试验

以马铃薯汁20%、蔗糖3%、酵母膏 0.5%、MgSO40.1%、KH2PO40.15% （pH自然）作为基础培养基， 摇瓶接种量分别按3%、6%、10%、15%、20%比例接种于液体培养基中培养。每种培养基平行做3个，进行指标测定。

1.4.9 不同摇瓶装量选择试验

以马铃薯汁20%、蔗糖3%、酵母膏 0.5%、MgSO40.1%、KH2PO40.15% （pH自然）作为基础培养基， 在250 mL三角瓶中分别装入60 mL、80 mL、100 mL、120 mL、140 mL液体培养基中培养。每种培养基平行做3个，进行指标测定[2－4]。

2 试验结果与分析

2.1 不同碳源对菌丝生长的影响

不同碳源对大马勃菌丝生长的影响指标中，菌丝干重（g·100－1·mL－1）分别为 0.2016、 0.2634、 0.6497、 0.5473、0.2243、 0.2467； 多 糖 含 量 （ mg·mL－1）分 别 为 7.454、14.3651、 16.5481、 14.5628、 14.248、 14.2842。 结果表明，在供试5种碳源中，大马勃菌丝能够利用葡萄糖、玉米粉、蔗糖、乳糖、麦芽糖，其菌丝长势和初级代谢产物多糖的含量以蔗糖为碳源时最佳；以葡萄糖、玉米粉、麦芽糖为碳源时较好；以乳糖为碳源时较差，菌丝长势较弱，多糖含量也较低。从菌丝长势和初级代谢产物多糖的含量来看，不同碳源顺序为蔗糖＞玉米汁＞葡萄糖＞麦芽糖＞乳糖，因此蔗糖为最佳碳源。

2.2 不同氮源对菌丝生长的影响

不同氮源对大马勃菌丝生长的影响指标中，菌丝干重（g·100－1·mL－1）分别为 0.5010、 0.6147、 0.6356、 0.5637、0.4829、 0.4743、 0.5832、 0.5013、 0.5459； 多糖含量 （mg·mL－1）分 别 为 14.4655、 15.053、 15.9805、 14.2482、 13.4249、11.858、 14.8007、 14.114、 12.8506。 结果表明， 在供试 8种氮源中，大马勃菌丝能够利用蛋白胨、酵母膏、豆饼粉、黄豆粉、麦麸汁、硝酸铵、硫酸铵、牛粪汁。在酵母膏为氮源的培养基中，菌丝长势最佳，多糖含量最高；当氮源是蛋白胨和麦麸汁时，菌丝长势较好，多糖含量接近；当氮源为其他时，菌丝生长较缓慢，多糖代谢也较少。不同氮源顺序为酵母膏＞蛋白胨＞麦麸汁＞豆饼粉＞牛粪汁＞黄豆粉＞硫酸铵＞硝酸铵，酵母膏为大马勃菌株的最佳氮源。

2.3 不同微量元素对菌丝生长的影响

不同微量元素对大马勃菌丝生长的影响指标中，菌丝干 重 （g·100－1·mL－1）分 别 为 0.4006、 0.4647、 0.4372、0.5734、 0.4145、 0.4562、 0.5441； 多糖含量 （mg·mL－1）分别 为 10.1642、 13.062、 11.804、 14.5275、 10.4514、13.439、14.2018。结果表明，在供试6种微量元素中，大马勃菌丝能够利用各种微量元素生长。在KH2PO4、MgSO4为微量元素的培养基中，菌丝长势最佳，多糖含量也最高；当微量元素是VB1和 NaH2PO4、KH2PO4、VB1时，菌丝长势较好，多糖含量接近；当微量元素为其他时，菌丝生长较缓慢，多糖代谢也较少。不同微量元素培养基的顺序 为 KH2PO4、 MgSO4＞VB1＞ NaH2PO4、 KH2PO4、 VB1＞KH2PO4＞ MgSO4＞ CaO、 KH2PO4、 VB1。 KH2PO4、 MgSO4为大马勃菌株的最佳微量元素。

2.4 正交试验结果

根据上述试验结果碳源选择蔗糖，氮源选择酵母膏，微量元素选择KH2PO4、MgSO4，进行正交试验考察，试验结果见表2。

通过方差分析表可知，各因素没有显著性差异，改用直观分析，结果可得最佳培养基组合为蔗糖3%、酵母膏0.75%、 KH2PO40.15%、 MgSO40.1%。

2.5 不同pH试验结果

不同初始pH对大马勃菌丝生长的影响指标中，菌丝干 重 （g·100－1·mL－1）分 别 为 0.4210、 0.4778、 0.5024、0.5913、 0.5721、 0.5046、 0.5127、 0.4130、 0.3837； 多糖含量 （ mg·mL－1）分 别 为 15.027、 15.3310、 15.1031、16.2793、 15.8917、 15.0239、 15.5714、 14.9335、 14.4096。结果表明，当pH值小于5.0或大于9时，大马勃菌丝不能生长；当pH值为6.5时，菌丝生物量达到最大值。当发酵初始pH值超过6.5时，随着pH值的升高，菌丝生物量逐步降低。因此发酵初始pH值6.5为大马勃液体发酵最适pH值。

表2 不同营养元素的正交试验结果

2.6 不同培养温度试验结果

不同培养温度对大马勃菌丝生长的影响指标中，菌丝干 重 （g·100－1·mL－1）分 别 为 0.3004、 0.4367、 0.4750、0.5299、 0.4349； 多 糖 含 量 （mg·mL－1）分 别 为 10.2762、10.3095、 12.1147、 14.596、 12.7008。 结果表明 ， 随着培养温度的不断升高，菌丝生物量不断增加，当温度达到28℃时，菌丝生物量和代谢指标多糖含量达到最大，但当培养温度继续增高时，菌丝生物量不再增加，反而降低。可见培养温度为28℃为大马勃液体发酵最佳培养温度。

2.7 不同接种量试验结果

不同接种量对大马勃菌丝生长的影响指标中菌丝干重（g·100－1·mL－1）分 别 为 0.237、 0.3064、 0.4796、 0.4249、0.443； 多 糖 含 量 （ mg·mL－1）分 别 为 8.459、 9.3712、12.0073、 11.809、 11.9136。 结果表明， 从菌丝生长发育速度、菌球干重及代谢指标多糖含量进行比较，接种量3%～6%菌丝生长发育速度慢、菌丝干重低、多糖含量少；接种量15%～20%与10%各项指标基本一致，未见明显差异，考虑接种量过大，浪费菌种，提高成本。因此以10%左右为宜。

2.8 不同摇瓶装量试验结果

不同摇瓶装量对大马勃菌丝生长的影响指标中菌丝干重 （ g·100－1·mL－1）分 别 为 0.2017、 0.3196、 0.3980、0.3714、 0.2914； 多 糖 含 量 （mg·mL－1）分 别 为 9.325、10.2071、 12.389、 12.906、 12.7834。 当摇瓶中培养基装量过少时，虽然溶氧量高，但摇瓶内菌丝生长所需的营养供给量不足，影响菌丝生长而导致菌丝生物量小；当摇瓶中培养基装液量大于100 mL时，由于溶氧量少，同样不利于菌丝生长，影响菌丝生物量。因此，250 mL三角瓶中装液量在100 mL左右较为合适，菌丝生物量最高。

3 讨论

本试验通过对大马勃液体发酵培养条件进行初步筛选，确定最佳液体培养基为马铃薯20%、蔗糖3%、酵母膏 0.75%、 KH2PO40.15%、 MgSO40.1% （pH 自然）； 培养条件为pH值6.5，温度28℃，接种量10%，摇瓶装量250 mL锥形三角形100 mL。为液体深层发酵工艺研究以及规范化、工厂化生产提供了理论依据。

[1]郑汉臣，蔡少青.药用植物学与生药学 [M].北京：人民卫生出版社， 2005(11)： 385－388.

[2]蔡丹凤，陈美元，郭仲杰，等.茯苓菌株生物学特性的研究[J].中国食用菌， 2009， 28(1)： 23－26.

[3]王涛，田文，游玲，等.大秃马勃深层培养条件初探[J].食用菌，2009(2)： 13－14.

[4]杨小方，薛璟，徐广忠，等.马勃液体培养条件的研究[J].包装与食品机械， 2009， 27(5)： 106－110.