赵成广，邓天麟，吴玉斌*

肾小管上皮细胞转分化(EMT)是肾间质纤维化的重要环节。肾间质纤维化时，约36%的成纤维细胞来源于肾小管局部EMT［1］。转分化的细胞以失去上皮细胞的标志物CK-18和出现间充质细胞标志物α-SMA为标志。EMT过程涉及肾小管基底膜的破坏及细胞增殖［2-3］，金属蛋白酶 9(MMP9)降解肾小管基底膜的Ⅳ型胶原，有利于转分化后的肾小管上皮细胞迁移到肾间质，通过增殖，加剧肾纤维化。近年来发现，表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate，EGCG)具有抗肝纤维化的作用［4-6］，EGCG是否对肾脏肾小管上皮细胞转分化有抑制作用尚无报道。本实验采用EGCG干预TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞株NRK细胞，通过检测CK-18、α-SMA及细胞中MMP9、细胞周期素(Cyclin)D1的表达改变，探讨EGCG对NRK细胞转分化的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 实验细胞:大鼠肾小管上皮细胞株(NRK-52E)，购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。L-EGCG购于 Sigma公司。TGF-β1购于 Peprotech 公司。α-SMA、CK-18、MMP9、Cyclin D1兔抗大鼠IgG(一抗)购于Santa Cruz公司。PrimeScriptTMRT Reagent Kit、Real time quantitive PCR(SYBRRPremix Ex TaqTM)试剂盒购于大连宝生物工程有限公司)。PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 试验方法 肾小管上皮细胞培养与分组:NRK-52E大鼠肾小管上皮细胞株常规培养，经无血清的DMEM培养基同步化作用24 h，之后将培养的细胞随机分为4组:1组:正常对照组(N)，以DMEM培养液为空白对照。2组:TGF-β1诱导组(培养液中TGF-β1的浓度为10 ng/mL)。3组:EGCG 200 μg/L 干预组，培养液中 TGF-β1的浓度为10 ng/mL，EGCG 浓度为 200 μg/L。4组:EGCG 400 μg/L 干预组，培养液中 TGF-β1的浓度为10 ng/mL，EGCG浓度为400 μg/L。各细胞组在作用48 h后收集细胞待测。

1.3 细胞爬片免疫组化测定 取1、2、3组同时进行细胞爬片，48 h后先PBS洗涤，再4%多聚甲醛固定，置于-20℃冰箱保存待测。……