赵 颖 牛膺筠 周占宇

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是我国老年人主要致盲眼病之一。AMD的发生与视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞的慢性氧化损伤关系密切［1］。我们此前研究发现，过氧化氢诱导的累积性氧化损伤可以引起体外培养的人RPE细胞形态呈老年性改变，并导致其凋亡和坏死［2］，但具体机制尚不清楚。因此，本研究在前期研究基础上，通过过氧化氢氧化损伤制作体外培养的人RPE细胞衰老模型，对人RPE细胞衰老的机制进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料 DMEM-F12培养基、新生牛血清、胰蛋白酶、青霉素和链霉素(美国Gibco生物技术公司)，人RPE细胞(ARPE-19细胞株，货号:CRL-2302;美国细胞培养收集公司)，过氧化氢(美国 Sigma公司)，碘化丙啶和罗丹明123染料(美国 Molecule Probe公司)，Caspases-9单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，PV6001免疫组织化学试剂盒和DAB显色试剂盒(北京中山生物技术公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 取生长良好的人RPE传代细胞，以每孔1×106个接种于4个6孔板中，培养24 h后，将原培养基吸出，换入新的DMEM-F12培养液，取4孔为正常对照组，其他20孔作为过氧化氢处理组加入600 μmol·L-1的过氧化氢，按过氧化氢的作用时段不同设1 h组、6 h组、12 h组、24 h组及72 h组，每组4孔。

1.2.2 流式细胞术测定细胞周期 各组经胰蛋白酶消化收获细胞，1 000 r·min-1离心5 min，离心半径为12 cm，弃上清液，轻震荡离心管使细胞脱壁，缓慢加入1 mL体积分数75%的冷乙醇固定，4℃过夜。1 000 r·min-1离心5 min，PBS液洗2次，加入100 μL 的 10 ×PI溶液，加入 100 μL RnaseA，37 ℃孵育30 min;流式细胞仪检测分析(激发光波长488 nm，发射光波长590 nm)，得出 G0/G1期细胞所占比例。

1.2.3 检测线粒体膜电位 各组经胰蛋白酶消化制备成细胞悬液，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清后重悬于不含钙镁的Hank液，加入罗丹明123(调整至终浓度 1 mg·L-1)，37℃ 孵育 30 min，1 000 r·min-1离心5 min，PBS清洗2次。……