张炘段传志李铁林龙霄翱何旭英谭峰方美凤黄彪

·论 著·

血小板活化特异性标志物PAC-1和CD62p与急性脑梗死病情严重程度的相关性☆

张炘*段传志*李铁林*龙霄翱**何旭英*谭峰△方美凤△黄彪△

目的 探讨急性脑梗死（acute cerebral infarction，ACI）患者血小板膜糖蛋白（glycoproteinⅡb／Ⅲa，GPⅡb／Ⅲa）纤维蛋白原受体PAC-1和P选择素（P-Selectin，CD62p）与ACI患者病情严重程度的相关性。方法采用流式细胞仪技术分别检测58例ACI患者急性期（＜7 d）外周血PAC-1和CD62p含量，同时采用Barthel指数和NIHSS量表评分法对ACI患者进行神经功能学评分，并选取20名健康人作为对照组进行参考值测定。结果 与对照组（0.22±0.13；4.21±1.11）相比，ACI患者 PAC-1含量（0.92±0.40）和 CD62p含量（7.07± 3.07）在急性期（＜7 d）显著升高（P＜0.05；P＜0.05），且与ACI患者病情严重程度成正相关（P＜0.05；P＜0.01）。 结论 PAC-1和CD62p与ACI患者病情严重程度呈正相关。早期检测PAC-1和CD62p水平对于预防ACI发生、评估病情轻重以及判断预后有着重要的意义。

PAC-1 CD62p ACI 病情 相关性

急性脑梗死（acute cerebral infarction，ACI）是由于急性脑供血障碍引起脑组织缺血、缺氧，神经元损伤的危重疾病，是人类疾病的三大死亡原因之一。脑血栓形成是脑梗死常见的病因［1-2］，血小板活化与微血栓形成密切相关［3-6］。 研究表明，血小板膜糖蛋白（glycoproteinⅡb／Ⅲa，GPⅡb／ⅢIa）纤维蛋白原受体 PAC-1和P选择素（P-Selectin，CD62p）是目前检测血小板活化程度和功能状态的特异性指标，检测PAC-1可以反映血小板早期活化情况［7-8］，而CD62P则是后期血小板活化的标志物［］。

目前，对于PAC-1和CD62p的研究更多停留在探讨其在ACI发生发展过程中的作用和意义上，而关于PAC-1和CD62p与ACI患者病情严重程度是存在直线性关联、是否有助于判断ACI患者预后的研究相对甚少。本文通过研究急性期ACI患者外周血PAC-1和CD62p的含量与ACI患者病情严重程度的相关性，为评估ACI患者病情轻重以及判断预后提供新的理论依据。

1 对象与方法

1.1 临床资料 选取2007年11月至2008年4月住院部ACI患者58例，其中男30例，女28例，年龄40～84岁，平均年龄为（67.67±10.52）岁；从发病到医院就诊时间最长为6 d，最短为4 h。诊断均符合1995年全国第四届脑血管病会议制定的诊断标准，且所有病例均经头颅CT或MRI确诊，排除其他存在的血栓及凝血性疾病。心电图、肝肾功能均正常。同时选取体检中心的健康人20名，其中男11名，女9名，年龄42～69岁，平均年龄为（59.70±9.49）岁。

1.2 病例标准

1.2.1 纳入标准 ①起病时间在1周以内，年龄在40～85岁之间；②颈内动脉系统第一次发生的单侧脑梗死；③本次发病前无严重残疾，mRS≤3；④NIHSS评分≥2；⑤符合上述诊断标准者均可作为试验病例。

1.2.2 排除标准 ①年龄＞85岁者或年龄＜40岁者；②短暂性脑缺血发作、蛛网膜下腔出血、脑出血、脑干和小脑梗塞者；③发病前有影响功能恢复的神经或肌肉骨骼疾病；④NIHSS评分≤1；⑤重度认知功能障碍；⑥急性心肌梗死、血液病、严重感染、活动性肺结核、肝肾功能严重损害、上消化道大出血患者；⑦已经服用影响血小板活化药物的患者。

1.2.3 剔除和脱落病例标准 ①未按规定治疗，无法判断疗效者；②资料不全者影响疗效或安全性判断者；③治疗过程中发生意外事件而不能坚持治疗者；④治疗过程中患者不配合治疗者。

1.3 指标检测

1.3.1 样品制备 采血：全部患者在入院第1天抽取静脉血3管（含0.1 mL的3.8%枸橼酸钠玻璃试管）各2 mL。

1.3.2 PAC-1和 CD62p的检测 第1、2管分别从中吸5 μL全血，分别加入对照管和实验管。剩下的全血加入ADP1 μmol刺激15 min，使血小板活化。从中再取5 μL全血分别加入FL1及FL2的补偿管中。加入3种荧光素标记的单克隆抗体。在对照管管中加入 FITC-IgM、PE-IgG1及，PerCP-CD61单抗各 20 μL。在FL1的补偿管中分别加入FITC-IgM、PerCD62P及Per-CP-CD61单抗各 20 μL。在FL2的补偿管中分别加入 FITCPAC1、PE-IgG1及PerCP-CD61单抗各20 μL。在实验管中分别加入FITC-PAC1、PE-CD62P及PerCP-CD61单抗各20 μL。室温，避光20 min后，用1%PFA250 μL固定10 min，1 h之内完成样品制备，采用流式细胞仪FACS Calibur（美国B.D公司）检测PAC-1和CD62p的阳性表达率。激发光为离子激光器488 nm单普线，功率15 mw。

1.4 神经功能评分 患者入院第1天，采用美国国立卫生研究院卒中量表（the NIH stroke scale，NIHSS）评分评估患者病情。评定标准 （1989年美国国立健康研究所）：NIHSS评分≤1为正常受试者，中风轻型 （NIHSS≤4）、中风中型（NIHSS在5～20分之间）、中风重型（NIHSS＞20分）。

1.5 统计学方法 采用SPSS 10.0统计分析系统进行分析。计量资料以（±s）表示，两组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析。相关性分析采用直线回归。检验水准a＝0.05。

2 结果

在急性期 （＜7 d），ACI患者PAC-1含量明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表1）；CD62p含量较健康人组也明显升高，差异有统计学意义 （P＜0.05）（见表2）。PAC-1和CD62p水平随着病情轻重的升高呈一个递增的趋势（表3、4）。

经直线分析，PAC-1与NIHSS评分高低之间存在直线关系 （t＝1.84，P＝0.04）（见表5图1）；CD62p与NIHSS评分高低之间也存在直线关系（t＝2.45，P＝0.00）（见表6图2）。进入回归方程，PAC-1与 NIHSS评分存在明显相关性 （P＜0.05），CD62p与NIHSS评分也存在明显相关性 （P＜0.01），说明PAC-1和CD62p水平高低与NIHSS评分高低呈正相关（表7），PAC-1和CD62p水平越高，NIHSS评分也越高，患者病情越严重。

3 讨论

3.1 血小板活化与脑血栓形成的关系 大量研究表明，血栓形成是急性脑梗死常见的病因［1－2］。脑血栓形成的发病因素包括血管内膜的损伤、血液流变学改变、血小板活性改变、纤溶活性改变等诸多因素，其中血小板活化是血栓形成的重要环节［3－4］。

在生理状态下，血小板基本处于静息状态，静息状态下的血小板并不黏附于内皮细胞形成聚集。病理状态时，血小板与血管壁相互作用，损伤的血管壁上暴露的胶原、凝血酶等促使血小板形态发生变化，伪足形成，Ca2＋流动和细胞内磷酸化反应，促使血小板在内皮细胞上黏附伸展，与纤维蛋白原连接，通过桥联作用促使血小板聚集，并释放活性内容物，后者作用于血管壁，使平滑肌细胞收缩并增殖，从而诱导血管痉挛，该过程统称为血小板的活化反应［10］。活化血小板是血栓主要成分之一，在ACI缺血和缺血－复流脑损害发生、发展过程中起着重要的作用［11］。在各种致病因素的作用下，血小板受到刺激被激活后发生黏附、聚集［12－13］，并释放出颗粒性物质，后者反过来促进血小板黏附、聚集过程和脑梗死的发生［5，14］。

表1 ACI组与对照组PAC-1含量的比较

表2 ACI组与对照组CD62p含量的比较

表3 不同病情ACI患者（NIHSS量表评分）与PAC-1的相互关系

表4 不同病情ACI患者（NIHSS量表评分）与CD62p的相互关系

表5 PAC-1和NIHSS评分的相关性分析

表6 CD62p与NIHSS评分的相关性分析

表7 NIHSS评分与ACI患者PAC-1和CD62p含量的相关性分析

3.2 PAC-1和CD62p与ACI的关系 GPⅡb／Ⅱa是血小板膜上的一种糖蛋白，GPⅡb／Ⅲa在受损血管的血小板黏附和血栓形成过程中起着重要作用［15－16］。血小板活化后10s内GPⅡb／Ⅲa最大限度活化［16］。PAC-1作为GPⅡb／Ⅲa复合物纤维蛋白原的受体，只与活化血小板上的GPⅡb／Ⅲa结合，与纤维蛋白原结合从而介导血小板聚集，是引起血小板聚集的最后通路。研究发现，PAC-1能结合活化的血小板，但不能结合未受刺激的血小板。因此，检测PAC-1可以反映血小板早期活化情况［7－8］。Meiklejohn等［9］用流式细胞术检测 150例脑梗塞患者发现，与对照组相比，患者PAC 1表达显著增加（P＜0.001）。

CD62P即P选择素，是由McEver等［17］首先在活化的血小板膜上发现的相对分子质量为140×103的糖蛋白，是血小板α颗粒发生释放反应的标志物，合成并储存于内皮细胞的Weibel Palade小体和α颗粒内。在凝血酶、组胺、氧自由基、肿瘤坏死因子等刺激下，血小板黏附、激活，使原本存在静息血小板胞浆内a颗粒膜上的糖蛋白CD62P迅速表达于活化的内皮细胞和血小板表面， 是后期血小板活化的标志物［7，9，16］。CD62P在血小板活化后 10 min表达可达高峰［14］。Belniak-Legiec等［6］用流式细胞术检测50例ACI患者发现，缺血性卒中急性期（第1、3和7天）CD62P表达呈显著增加。Meiklejohn等［9］发现，血栓性卒中患者 CD62P表达较对照组显著增加（0 64%对0 35%，P＜0.001）。Yip等［5］用流式细胞术对87例ACI者进行检测发现，CD62P表达在急性期较对照组显著增加。

3.3 PAC-1和CD62p与ACI病情严重程度的相关性 PAC-1和CD62p作为血小板早期和晚期活化的标志性指标，不仅能反映ACI早期血小板活化状态，还能反映ACI患者病情的严重性。Cha等［18］发现急性期缺血性卒中病人CD62p的表达和疾病的恶化明显呈正相关，并提出CD62p的表达升高是病情进程恶化的一个标志。本实验结果发现，在ACI早期，PAC-1水平与NIHSS评分存在明显正相关 （P＜0.05），CD62p水平与NIHSS评分也存在明显正相关（P＜0.01），通过直线回归分析，我们发现，PAC-1和CD62p与NIHSS评分存在明显的线性关系，说明ACI患者血中PAC-1和CD62p水平越高，NIHSS评分也越高，患者病情程度越严重。因此，PAC-1和CD62p水平高低可以在一定程度上反映患者病情，早期检测ACI患者血中PAC-1和CD62P水平，可以及时了解患者病情严重情况。

3.4 结语 PAC-1和CD62p与ACI作为血小板活化的特异性标志物能在早期反应机体血小板活化程度，且与患者病情严重程度呈正相关。早期检测PAC-1和CD62p水平对于预防ACI发生、评估病情轻重以及判断预后有着重要意义。

图1 PAC-1和NIHSS评分的相关性分析

图2 CD62p与NIHSS评分的相关性分析

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（责任编辑：李立）

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A

2011－02－22）

☆ 广东省医学科学技术研究基金项目（编号：WSTJJ 20051101430103590927157）

* 南方医科大学珠江医院神经外科，广东神经外科研究所（广州 510282）

△ 广州中医药大学附属佛山中医院神经内科