彭正午薛芬席敏王化宁乔昱婷谭庆荣

·论 著·

帕罗西汀对海马星形胶质细胞增殖的作用及其机制研究☆

彭正午*薛芬*席敏*王化宁*乔昱婷*谭庆荣*

目的 探讨帕罗西汀对星形胶质细胞细胞增殖的作用及其相关机制。方法 原代培养海马星形胶质细胞，随机分为4个研究组和对照组（sham组）。研究组细胞分别直接给予终浓度为5、10、20和50 μmoL／L剂量的帕罗西汀，处理24或48 h。采用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测星型胶质细胞活性，免疫细胞化学观察细胞形态学改变，5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）检测细胞增殖情况，蛋白质印迹法（Western blotting）检测磷酸化细胞外信号调节激酶（phosphorylatged extracellular single-regulated kinase，pERK1／2）的表达水平。结果48 h后各组的星形胶质细胞活力、BrdU阳性细胞数量以及pERK1／2的表达差异均有统计学意义（P＜0.001），进一步两两比较，10 μmoL／L帕罗西汀组的上述3个指标均高于其他剂量组和对照组（P＜0.01）；而50 μmoL／L帕罗西汀组细胞活力均低于其他组（P＜0.01）。5、10和20 μmoL／L帕罗西汀组作用24或48 h后，细胞活力、BrdU阳性细胞数量以及pERK1／2的表达与对照组之间无差异（P＞0.05）。结论 帕罗西汀能够促进星形胶质细胞的活性和增殖，而且这种作用可能与ERK信号通路有关。

帕罗西汀 星形胶质细胞 增殖作用

既往认为选择性5-羟色胺回收抑制剂（selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI）的作用机制主要是通过抑制突触前膜对突触间隙5-HT的再摄取来提高突触间隙 5-HT的浓度［1］，从而改善抑郁症状。但近年，有研究显示抑郁症患者海马体积萎缩［2－3］，而抗抑郁药治疗可以部分缓解这些现象［4］，并可以促进海马神经发生［5－6］，提示对海马神经发生的调节作用可能是抗抑郁药物的作用机制之一［7］。进一步的研究发现，抑郁症模型大鼠海马还存在星形胶质细胞凋亡的现象，而给予SSRI类的氟西汀干预后可抑制其凋亡［8］，提示对海马星形胶质细胞的作用也可能是抗抑郁药作用的靶点之一。本研究通过观察另一种SSRI类抗抑郁药－帕罗西汀对离体海马星形胶质细胞增殖、凋亡的影响及磷酸化细胞外信号调节激酶（phosphorylatged extracellular single-regulated kinase，pERK1／2）的表达的变化，探讨帕罗西汀对星形胶质细胞的作用及其相关机制，进而为探讨SSRI类抗抑郁药作用的可能机制提供线索。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及药物处理 星形胶质细胞进行原代培养，取出新生SD大鼠的海马组织，机械剪碎并吹散，过200目筛网，将细胞接种于由多聚赖氨酸包被的培养瓶中，以含10%胎牛血清的DMEM培养14 d后在37℃恒温摇床250 r／min条件下震摇过夜，弃去培养基，以分离得到纯化的星型胶质细胞。纯化后的星型胶质细胞以含10%胎牛血清的DMEM继续培养。帕罗西汀 （Sigma）用DMSO溶解后，用DMEM培养基将其稀释为不同浓度，并使培养基中DMSO的终浓度为0.1%。对照组为含0.1%DMSO的DMEM培养基。

1.2 星形胶质细胞纯度鉴定 纯化后的星型胶质细胞，以2×104个／孔接种于多聚赖氨酸包被的24孔板中。接种2 h后行免疫细胞化学染色以鉴定其纯度。以4%多聚甲醛固定细胞1 h，经1%的BSA（犊牛血清白蛋白）封闭30 min后，孵育一抗过夜（mouse anti-GFAP，Millipore，1∶400）。经PBS漂洗，孵育二抗2 h（Alexa Fluor 594 donkey antimouse IgG，Invitrogen，1∶1000），并用DAPI（Roche）染细胞核，经漂洗后，50%甘油封片，并在FV-1000型激光共聚焦显微镜（OLYMPUS）下观察并照相。计算神经胶质酸性蛋白（GFAP）阳性细胞在所有细胞中占有的比例。

1.3 星形胶质细胞活性测试 星形胶质细胞以5 ×104个／mL接种于96孔板，每孔100 μL。在其上清液中添加不同浓度的帕罗西汀 （每组重复6孔），作用24 h或48 h后检测细胞活力，以检测帕罗西汀直接作用后，对其细胞活力的影响。处理结束后，每孔再加入2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐（cck-8，碧云天）溶液10 μL，再继续培养2 h后，用 Dynatech MR4000型酶联免疫读数仪检测其OD值，实验波长450 nm。

1.4 星形胶质细胞的形态学观察 星型胶质细胞以2×104个／孔接种于多聚赖氨酸包被的24孔板中。在其培养基中添加5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）（Sigma，终浓度10 μmoL／L）及帕罗西汀，每组重复5孔。作用48 h后，经行免疫细胞化学染色。以4%多聚甲醛固定细胞1 h，2N的HCl在37℃作用30 min后，以0.1 mol／L的硼酸缓冲液（pH 8.5）作用10 min，经1%的BSA封闭30 min后，孵育一抗过夜 （rabbit anti-GFAP，Millipore， 1∶400；mouse anti-BrdU，Sigma，1∶500）。经PBS漂洗，孵育二抗2 h（Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG，Invitrogen，1∶1000；Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG，Invitrogen，1∶500），经漂洗后，50%甘油封片，并在FV-1000型激光共聚焦显微镜下观察并照相。

1.5 Western blot检测pERK1／2表达水平 帕罗西汀作用48 h后，细胞经蛋白质抽取试剂（1 mL RIPA抽提试剂中加入5 μL蛋白酶抑制剂混合液和5 μL PMSF）提取蛋白质，经变性后，按BCA蛋白定量结果，取总蛋白为40 μg的样品经10%SDS-PAGE（十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺）电泳，转移至NC膜；以封闭液（25 mmoL／L TBS溶液，5 g／L脱脂奶粉，1 ml／L吐温-20）室温封闭1 h。加入相应抗体4℃孵育过夜（rabbit anti-pERK1／2，Cell Signalling，1∶2500；mouse anti-β-actin，Sigma，1∶6000），洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，经化学荧光试剂显影（Millipore），在暗室中用X光胶片压片成像。扫描各免疫印迹条带并进行分析。

1.6 图像半定量分析 每张细胞爬片在20或40倍物镜下取8个视野，用图像分析软件（Image-Pro Plus 6.0）分析计算图片中阳性细胞数量，求平均值。扫描的Western blot底片用Image J分析条带的阳性产物面积，计算阳性产物与β-actin面积比。

1.7 统计分析 应用SPSS 13.0统计分析，统计数据均采用均数±标准差（±s）表示。各组之间的比较用单因素方差分析，各组数据呈正态分布并经方差齐性检验后，两两比较采用最小显著差异法（LSD）。检验水准α＝0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 星形胶质细胞的纯度鉴定 原代培养的星形

胶质细胞，经免疫细胞染色后，其纯度在95%以上，可以用于实验。鉴定图片见图1。

2.2 帕罗西汀对星形胶质细胞活力的作用 帕罗西汀直接作用于星形胶质细胞24 h后5 μmoL组、10 μmoL组、20 μmoL组与sham组吸光度分别为（0.54±0.05）、（0.53±0.08）、（0.49±0.01）、（0.011± 0.01）、（0.56±0.02），各组之间的差异有统计学意义（F＝86.895，P＜0.001），两两比较显示，仅50 μM组吸光度低于其他各组（P＜0.01）。

帕罗西汀直接作用于星形胶质细胞48 h后，5 μmoL组、10 μmoL组、20 μmoL组与sham组吸光度依次为 （0.56±0.05）、（0.65±0.01）、（0.52± 0.02）、（0.10±0.01）和（0.54±0.03），差异也有统计学意义（F＝294.33，P＜0.001），其中10 μmoL组吸光度显著高于sham组 （P＜0.01），50 μmoL组吸光度显著低于其他处理组（P＜0.001）。

2.3 帕罗西汀对星形胶质细胞增殖的作用 帕罗西汀直接作用于星形胶质细胞48 h后， 5 μmoL组、10 μmoL组、20 μmoL组与sham组BrdU＋细胞数量分别为（69.21±6.22）、（99.40±10.01）、（66.80 ±7.46）和（71.20±9.36），各组的差异有统计学意义（F＝15.446，P＜0.001），其中10 μmoL组显著高于其他处理组（P＜0.01）。

2.4 帕罗西汀对星形胶质细胞pERK1／2表达的影响 帕罗西汀直接作用于星形胶质细胞48 h后，5 μmoL组、10μmoL组、20μmoL组与sham组pERK1／2表达水平（与β-actin比对）分别为（0.84±0.10）、（1.24 ±0.04）、（0.75±0.08）和（0.91±0.17），组间差异有统计学意义（F＝14.10，P＜0.001），其中10μmoL组显著高于其他处理组（P＜0.01）。

3 讨论

星形胶质细胞不仅对神经元有支持、营养的作用，而且对突触功能活动的调节具有重要作用［9］。而星形胶质细胞在抑郁症的病理生理中可能发生了一定作用［10］。研究表明，抑郁症患者大脑边缘系统的星形胶质细胞密度和功能显著下降［11］。进一步的研究发现，星型胶质细胞能表达功能性的 5-HT受体［12］，抗抑郁药物能够直接作用于星形胶质细胞上的5-HT受体，激活细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路，并进一步调节星型胶质细胞钙信号，起到抑制其凋亡的作用［13］。还有研究发现SSRI类抗抑郁药能通过快速上调ERK水平，增加胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）的表达，从而发挥其神经保护作用［14］。因此，抗抑郁药可能通过作用于星型胶质细胞并通过ERK通路来发挥其生物学功能，但需要进一步证实。

图1 星型胶质细胞的纯度鉴定

图2 不同剂量帕罗西汀作用48 h后星型胶质细胞GFAP和BrdU染色情况。Bar＝200 μm

本研究结果显示，中等浓度（10 μmoL）帕罗西汀不仅能促进体外培养的海马星形胶质细胞的细胞活力，而且还能够促进星形胶质细胞的增殖。这与氟西汀对在体抑郁动物模型作用的研究结果相一致［15］：长期给予氟西汀处理，不仅能够促进大鼠海马神经发生，而且还能促进海马星形胶质细胞S100beta的表达。上述研究表明，星形胶质细胞可能是SSRI类抗抑郁药物作用的靶点之一。同时，本研究结果也进一步显示，中等剂量的帕罗西汀能够促进海马星形胶质细胞pERK1／2的表达。既往的在体研究发现，抑郁大鼠海马pERK1／2的表达降低，而长期给予帕罗西汀能够上调ERK和CREB磷酸化水平［16］，提示帕罗西汀对星形胶质细胞的作用可能与ERK信号通路的活性有关。

图3 帕罗西汀作用于星形胶质细胞48 h后各组pERK1／2的表达。**：与其他任一处理组比较，经LSD检验，P＜0.01

本研究还观察到高浓度（50 μmoL）帕罗西汀抑制星型胶质细胞活力，而且具有毒性作用（结果未提供）。因此并没有进一步观察该浓度条件下的增殖情况和pERK1／2的表达情况。这一结果提示临床使用大剂量的帕罗西汀可能会造成星型胶质细胞的损伤，而且高剂量帕罗西汀诱发的药物副反应也可能与此有关。

总体而言，本研究结果表明，帕罗西汀对海马星形胶质细胞增殖具有促进作用，其作用机制可能与ERK信号通路的激活有关，因此星形胶质细胞可以作为一种研究抗抑郁药物作用机制的细胞模型。要进一步阐述星形胶质细胞在帕罗西汀治疗和产生副反应过程中的作用，以及帕罗西汀对星形胶质细胞的作用机制，还需要进一步观察ERK信号通路抑制剂的作用，并在在体动物实验中加以研究。

［1］Butler SG， Meegan MJ.Recent developments in the design of anti-depressive therapies：targeting the serotonin transporter［J］.Curr Med Chem，2008，15（17）：1737－1761.

［2］Colla M，Kronenberg G，Deuschle M，et al.Hippocampal volume reduction and HPA-system activity in major depression［J］.J Psychiatr Res，2007，41（7）：553－560.

［3］ 邹可，孙学礼.难治性抑郁症脑影像学研究进展［J］.中国神经精神疾病杂志，2009，35（4）：261－263.

［4］ 王丽，姚志剑，卢青，等.重度抑郁症症状缓解前后海马局部一致性研究［J］.中国神经精神疾病杂志，2010，36（05）：264－267.

［5］Santarelli L，Saxe M，Gross C，et al.Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants［J］.Science，2003，301（5634）：805－809.

［6］Jin Y，Lim CM，Kim SW，et al.Fluoxetine attenuates kainic acid-induced neuronal cell death in the mouse hippocampus［J］.Brain Res，2009，1281（24）：108－116.

［7］Kodama M，Fujioka T，Duman RS.Chronic olanzapine or fluoxetine administration increases cell proliferation in hippocampus and prefrontal cortex of adult rat［J］.Biol Psychiatry，2004，56（8）：570－580.

［8］Czeh B，Simon M，Schmelting B，et al.Astroglial plasticity in the hippocampus is affected by chronic psychosocial stress and concomitant fluoxetine treatment［J］.Neuropsychopharmacology，2006，31（8）：1616－1626.

［9］Haydon PG，Carmignoto G.Astrocyte control of synaptic transmission and neurovascular coupling［J］.Physiol Rev，2006，86（3）：1009－1031.

［10］Hercher C，Turecki G，Mechawar N.Through the looking glass：examining neuroanatomical evidence for cellular alterations in major depression［J］.J Psychiatr Res，2009，43（11）：947－961.

［11］Gosselin RD，Gibney S，O'Malley D，et al.Region specific decrease in glial fibrillary acidic protein immunoreactivity in the brain of a rat model of depression［J］.Neuroscience，2009，159（2）：915－925.

［12］Zhang S，Li B，Lovatt D，et al.5-HT2B receptors are expressed on astrocytes from brain and in culture and are a chronic target for all five conventional‘serotonin-specific reuptake inhibitors’［J］.Neuron Glia Biol，2010，6（2）：113－125.

［13］Schipke CG，Heuser I，Peters O.Antidepressants act on glial cells： SSRIs and serotonin elicit astrocyte calcium signaling in the mouse prefrontal cortex［J］.J Psychiatr Res，2011，45（2）：242－248.

［14］Hisaoka K， Nishida A， Koda T， et al.Antidepressant drug treatments induce glial cell line-derived neurotrophic factor（GDNF）synthesis and release in rat C6 glioblastoma cells［J］.J Neurochem，2001，79（1）：25－34.

［15］Manev H，Uz T，Manev R.Glia as a putative target for antidepressant treatments［J］.J Affect Disord，2003，75（1）：59－64.

［16］郑晖，马光瑜，付晓春.帕罗西汀对抑郁模型大鼠空间学习记忆和海马ERK-CREB通路的效应［J］.中国药学杂志，2008，（16）：1234－1238.

The effect of paroxetine on the proliferation of the hippocampus-derived astrocytes.

PENG Zhengwu，XUEFen，Xi Min，WANG Huaning，Qiao Yuting，TAN Qingrong.Department of Psychosomatic Medicine，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi’an 710032.China.Tel：029－84771141.

Objective To investigate the effect of paroxetine on the proliferation of hippocampus-derived astrocytes，and explore its potential molecular mechanism.Methods Astrocytes were isolated from the hippocampus of fetal rats and were treated with different concentrations of paroxetine.The cells viability，BrdU labeling and detection and the level of phosphorylatged extracellular single-regulated kinase（pERK1／2）were measured by using the kit of CCK-8，immunocytochemical method and western blot，respectively.Results The cell viability，number of BrdU＋cells and expression of pERK1／2 in 10 μmoL／L paroxetine treated groups were significantly increased compared to the control and other groups 48 h after treatment.However，there were no significant differences in the cell viability，number of BrdU＋cells and expression of pERK1／2 among paroxetine 5 μmoL／L， 20 μmoL／L treated groups and control.Moreover，the cell viability was significantly decreased in 50 μmoL／L group.Conclusions Paroxetine can enhance the proliferation of the hippocampus-derived astrocytes via the ERK pathway.

Paroxetine Hippocampus Astrocytes Proliferation

R749.3

A

2011－05－06）

（责任编辑：曹莉萍）

☆ 国家自然科学基金资助项目（编号：30870886）

* 第四军医大学西京医院心身科（西安 710032）

（Email：tanqingr＠fmmu.edu.cn）