方玲王柠林珉婷慕容慎行

·论 著·

内皮型一氧化氮合酶基因第4内含子基因多态与福建汉族脑血管病的相关性☆

方玲*王柠*林珉婷*慕容慎行*

目的 研究福建汉族人内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）基因第4内含子27 bp可变串联重复序列（variable number of tandem repeat，VNTR）与脑血管病关系。方法 依据缺血性卒中TOAST（Trial of ORG 10172 in Acute Stroke Treatment）分型收集132例大动脉粥样硬化性卒中 （large artery atherosclerosis，LAA），63例腔隙性脑梗死（lacunar infarction，LI）及62例高血压性脑出血患者为病例组，同时选择年龄、性别匹配的237名健康者为对照组，采用聚合酶链反应结合2%琼脂糖电泳技术检测eNOS基因第4号内含子27 bp VNTR的多态性。结果 正常福建汉族人eNOS基因第4内含子除bb，ab，aa基因型外，尚出现罕见的 bc基因型，其基因型频率分别为 0.789，0.203，0.004，0.004；b、a、c等位基因频率分别为.892，0.106及0.002。LAA及LI患者27 bp VNTR多态与对照组差别无统计学意义，LAA组bc基因型频率（0.030）虽明显高于对照组（0.004），但差异无统计学意义；缺血性卒中伴／不伴高血压病与该基因多态无相关性。高血压性脑出血患者的aa基因型频率为0.048，明显高于bb＋ab基因型（OR＝11.42，95%CI：1.209－117.892，P＜0.05）。结论eNOS第4内含子aa基因型可能是福建汉族人高血压性脑出血的遗传危险因素，但该位点多态性与福建汉族LAA及LI无相关性。

脑血管病 内皮型一氧化氮合酶 基因多态

脑血管病是由遗传和环境因素叠加损害脑血管所致。高血压病（essential hypertension，EH）是脑血管病最重要和独立的危险因素，与大动脉粥样硬化性卒中（large artery atherosclerosis，LAA）、腔隙性脑梗死（lacunar infarction，LI）及脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）均有密切关系。研究表明内皮型一氧化氮合酶 （endothelial nitric oxide synthase，eNOS）基因第4内含子的27 bp VNTR与EH发病相关［1－2］，并可能与缺血性卒中相关，但结果存在争议［3－8］。我们以福建汉族人群为研究对象，探讨该基因多态性与脑血管病的关系。

1 材料和方法

1.1 研究对象 ①对照组：无亲缘关系的健康体检人员共237名（男190名，女47名），年龄（61.5 ±10.6）岁，均为福建汉族人。无卒中家族史，无肝、肾、甲状腺病史、糖尿病及心脑血管病史；②缺血性卒中组：本院神经内科住院缺血性卒中患者195例，男 150例，女 45例，平均年龄（62.5± 10.9岁，均为福建汉族人，无亲缘关系。符合1996年全国脑血管病诊断标准［9］，并经头颅 CT和（或）MRI证实。根据 TOAST分型［10］，入选 LI患者63例，LAA患者132例，其中有高血压病的LAA患者71例，排除心源性卒中、动脉炎、外伤、血液病、药物等原因引起的脑梗死；③高血压性脑出血组：患者62例，男50例，女12例，平均年龄（59.4±15.9）岁，高血压病符合1997年WHO诊断标准，排除继发性高血压。排除脑梗死、肿瘤、血液病、动脉炎、药物、脑血管畸形或动脉瘤等引起的继发性脑出血。

1.2 研究方法

1.2.1 基因组DNA的提取 抽取研究对象外周静脉血2 mL，以DNA抽提试剂盒（Amersham Phamacia公司）抽提基因组DNA。

1.2.2 合酶链反应（PCR）扩增－琼脂糖凝胶电泳检测 引物序列参照文献［11］，上游引物：5′-AGGCC CTATGGTAGTGCCTTT-3′，下游引物：5′-TCTCTTAGTGCTGTGGTCAC-3′。PCR反应体系50 μl：基因组DNA 250 ng，dNTP各200 μmol／L，MgCl21.5 mmol／L，上下游引物各0.25 μmol／L，Taq酶2.5 U及其1×缓冲液。试剂由上海生工公司提供。扩增条件：94℃预变性2 min，93℃45 s，54℃45 s，72℃1 min，30次循环周期后72℃延伸5 min。取PCR产物5 μl与等体积加样缓冲液混合后采用2.0%琼脂糖凝胶电泳，80V电压电泳1.5～2 h，以100 bp Marker为分子量标记，紫外灯下根据片段大小判断基因型并拍照（图1）。PCR扩增产物片段分别为393 bp（4a）、420 bp（4b）及罕见的447 bp（4c）。

1.2.3 DNA序列分析 将447 bp条带以低熔点琼脂糖回收并以Qiaquick Spin（Qiagen公司）过柱纯化后采用 ABI PRISMTM 3730自动测序仪进行DNA序列分析（图2）。

1.3 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件包对数据进行统计分析，以Handy-Weinberg平衡评估样本的群体代表性，组间频率比较采用χ2检验，检验水准α＝0.05。

2 结果

图1 eNOS基因第4内含子琼脂糖电泳图

图2 eNOS基因第4内含子c等位基因测序图

2.1 不同种族正常人群eNOS基因第4内含子27 bp VNTR基因型及基因频率 福建汉族正常人群eNOS基因内含子4有bb，ab，aa，bc四种基因型，符合Handy-Weinberg平衡。不同种族人群中bb基因型均为最常见的类型［4，12－13］，西班牙及印度人aa基因型多于中国人［4，12］；非裔美国人 c等位基因频率高于其他种族人群，且出现ac基因型［13］。

2.2 缺血性卒中亚型eNOS基因27bpVNTR基因型及基因频率 LAA组及LI组基因型均符合Handy-Weinberg平衡，与对照组相比差别无统计意义。在病例组检测出bc型5例，LAA组bc基因型频率虽高于对照组，但无统计学差异。

2.3 高血压性脑出血及伴高血压病的大动脉粥样硬化性卒中eNOS基因27bpVNTR基因型及基因频率 伴或不伴有高血压病的LAA组及高血压性脑出血组基因型均符合Handy-Weinberg平衡，伴或不伴有高血压病的LAA组与对照组相比差别无统计学意义。在高血压性脑出血组，aa基因型者高于对照组（P＜0.05），与bb＋ab基因型相比，其相对危险度为11.42。

3 讨论

一氧化氮（NO）是由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化L－精氨酸生成。NOS分为三型，Ⅰ型为神经元型（neuronal nitric oxide synthase，nNOS），Ⅱ型为诱导型NOS（inducible nitric oxide synthase，iNOS），Ⅲ型为内皮型NOS（eNOS）。由eNOS合成的NO是最强的内源性血管扩张因子，具有抑制血小板的粘附聚集及血管内皮增殖的作用，NO下降可引起脑灌注量减少，脑血流自动调节功能降低，血脑屏障及血管重建功能破坏，因而与血管性疾病如高血压病、冠心病、脑血管病、肾病以及深部静脉血栓有关［11－13］。

eNOS基因位于人类7q35-36，含有26个外显子，跨距约21 kb。eNOS基因4号内含子存在27 bp VNTR，该重复序列为［GAAGTCTAGACCTGCTGC（A／G）GGGGTGAG］，重复5次者（b）第19个碱基前3次重复为A，后2次重复为G；重复4次者（a）第19个碱基前2次重复为A，后2次重复为G。重复6次者（c）第19个碱基前3次为A，后3次为G，虽然c等位基因在印度、西班牙、德国、捷克、非裔美国人中均有发现，但由于其很罕见，在进行统计学处理时常被忽略不计。我们在福建汉族人群中也检测到该罕见片段，虽然27 bp VNTR位于内含子区，对转录的调节可能并不起作用，但已有资料表明，4号内含子的变异可能有功能或通过与功能性位点连锁而与NO水平相关［2］，aa基因型对NO升降的影响尚有争议［5，14－15］。

表1 不同种族人群eNOS基因4号内含子27 bp VNTR的基因型及等位基因频率

表2 缺血性卒中亚型eNOS基因27 bp VNTR的基因型及基因等位基因频率

表3 高血压性脑出血及伴高血压病的大动脉粥样硬化性卒中eNOS基因27 bp VNTR的基因型及等位基因频率

不同种族人群eNOS基因27bpVNTR多态与脑血管疾病的关系有差异［4－8］。Hassan［5］及Yemisci等［6］研究认为由eNOS合成NO的减少易致穿支动脉近端小动脉硬化而引起LI，4a等位基因是LI的保护因子。葛汝丽等［8］认为a等位基因是2型糖尿病合并脑梗死的危险因素。印度一项研究［4］认为4a／b基因型与年青妇女早发卒中相关。但近来一项meta分析［3］认为4a／b基因多态与缺血性卒中无关。既往研究认为缺血性卒中TOAST分型中遗传因素对LAA及LI影响较大［16］，因而我们主要对这两种缺血性卒中亚型与eNOS基因多态的关系进行分析。正常福建汉族人群该位点基因型及等位基因频率与其他种族有差别，说明不同种族人群的遗传背景存在差异。本研究中未发现该位点多态性与福建汉族缺血性卒中LAA及LI亚型相关。在缺血性卒中患者中bc基因型明显高于正常人群，但在进行统计学处理时无显著性差别。4c等位基因频率在非裔美国人中较高，认为是非裔美国人缺血性卒中的遗传标志之一［7］。因而我们认为4c等位基因与福建汉族人缺血性卒中特别是LAA可能有关，但尚需在更大样本的人群中进行检测。

高血压病是脑血管病的传统的独立危险因素，与缺血性卒中的LAA及LI亚型均有密切的关系，另一方面高血压病也是脑出血最常见及最主要的病因。同一种危险因素引发脑血管不同的病理过程与其基因型的关系尚不明确。本研究中发现aa基因型与高血压性脑出血相关 （OR＝11.42），但该基因多态与高血压伴LAA无相关性，因而认为eNOS第4内含子aa基因型可能是福建汉族高血压性脑出血的遗传危险因素。aa基因型可能通过影响eNOS的表达而改变NO合成水平，从而影响脑血管收缩舒张、血小板聚集及血管平滑肌增殖。但由于国内外对aa基因型与高血压性脑出血关系的研究很少，其机制尚待进一步研究。

由于脑血管病的发生与年龄、吸烟、高血压病、糖尿病等多种因素有关，不同研究结果的差异可能与种族及地区差异有关，或与取样有关。因而对脑血管病人群进行基因多态研究时应收集大样本根据病因及发病机制进行分型，可能会得到更准确的结果。

［1］Jemaa R，Ben Ali S，Kallel A，et al.Association of a 27-bp repeat polymorphism in intron 4 of endothelial constitutive nitric oxide synthase gene with hypertension in a Tunisian population［J］.Clin Biochem，2009，42（9）：852－856.

［2］Miyamoto Y，Saito Y，Kajiyama N，et al.Endothelial nitric oxide synthase gene is positively associated with essential hypertension［J］.Hypertension，1998，32（1）：3－8.

［3］Tao HM， Chen GZ.Endothelial NO synthase gene polymorphisms and risk of ischemic stroke：a meta-analysis［J］.Neurosci Res，2009，64（3）：311－316.

［4］Majumdar V，Nagaraja D，Karthik N，et al.Association of endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms with early-onset ischemic stroke in South Indians［J］.J Atheroscler Thromb，2010，17（1）：45－53.

［5］Hassan A，Gormley K，O′Sullivan M，et al.Endothelial nitric oxide gene haplotypes and risk of cerebral small－vessel disease［J］.Stroke，2004，35（3）：654－659.

［6］Yemiç■M， Sinici I， Ozkara HA， et al.Protective role of 27bp repeat polymorphism in intron 4 of eNOS gene in lacunar infarction［J］.Free Radic Res，2009，43（3）：272－279.

［7］Grewal RP，Dutra AV，Liao YC，et al.The intron 4c allele of the NOS3 gene is associated with ischemic stroke in African Americans［J］.BMC Med Genet，2007，8：76.

［8］ 葛汝丽，陈方民，韩笑峰，等.eNOS基因多态性与2型糖尿病并脑梗死的相关性研究［J］.中国神经精神疾病杂志，2005，31（5）：391－392.

［9］ 中华神经科学会，中华神经外科学会.各类脑血管疾病诊断要点［J］.中华神经科杂志，1996，29（6）：379－380.

［10］Adams HP，Bendixen BH，Kappelle LJ，et al.Classification of subtype of acute ischemic stroke： definitions for use in a multicenter clinical trial［J］.Stroke，1993，24：35－41.

［11］Pulkkinen A，Viitanen L，Kareinen A，et al.Intron 4 polymorphism of the endothelial nitric oxide synthase gene is associated with elevated blood pressure in type 2 diabetic patients with coronary heart disease［J］.J Mol Med，2000，78（7）：372－379.

［12］Ordóñez AJ，Carreira JM，Franco AG，et al.Two expressive polymorphisms on the endothelial nitric oxide synthase gene（intron4，27 bp repeat and－786 T／C）and the venous thromboembolism［J］.Thromb Res，2000，99（6）：563－566.

［13］Hooper WC，Lally C，Austin H，et al.The relationship between polymorphisms in the endothelial cell nitric oxide synthase gene and the platelet GPIIIa gene with myocardial infarction and venous thromboembolism in African Americans［J］.Chest，1999，116（4）：880－886.

［14］Tsukada T，Yokohama K，Arai T，et al.Evidence of association of the ecNOS gene polymorphism with plasma NO metabolite levels in humans［J］.Biochem Biophys Res Commun，1998，245（1）：190－193.

［15］Yoon S，Moon J，Shin C，et al.Smoking status-dependent association of the 27－bp repeat polymorphism in intron 4 of endothelial nitric oxide synthase gene with plasma nitric oxide concentrations［J］.Clin Chim Acta，2002，324（1－2）：113－120.

［16］Flossmann E，Schulz UGR，Rothwell PM.Systematic review of methods and results of studies of the genetic epidemiology of ischemic stroke［J］.Stroke，2004，35：212－227.

Association of endothelial nitric oxide synthase gene intron 4 polymorphisms with cerebrovascular disease in Han population of Fujian.

FANG Ling，WANG Ning，LIN Minting，MURONG Shenxing.Department of Neurology，1st Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Fuzhou，Fujian 350005，China.Tel：15960090169.

Objective To investigate the association of 27 bp variable number of tandem repeat（VNTR）polymorphisms in intron 4 of endothelial nitric oxide synthase（eNOS）gene with cerebrovascular disease in Han population of Fujian. Methods We characterized and studied 132 patients with large artery atherosclerosis（LAA）、63 cases with lacunar infarction（LI）according to TOAST（Trial of ORG 10172 in Acute Stroke Treatment）classification，and 62 cases with hypertensive intracerebral hemorrhage and 237 unrelated health individuals in Han population of Fujian， the 27 bp VNTR polymorphisms were detected by polymerase chain reaction and 2%agarose gel electrophoresis.Results All genotypes were in Handy-Weinberg equilibrium.Among the controls the frequencies of four genotypes bb，ba，aa，bc were 0.789，0.203，0.004，0.004，respectively，the bc genotype was rare.The allelic frequencies of b，a，and c were 0.892，0.106 and 0.002.No Significant associations of 27 bp VNTR polymorphisms with ischemic stroke were observed；although the bc genotype was overrepresented in LAA（0.030），the trend did not reach significance.The polymorphisms were not related to LAA／LI with or without hypertension.The frequency of aa genotype in hypertensive cerebral hemorrhage patients was 0.048 and significantly higher than that of bb＋aa genotype（OR＝11.42，95%CI：1.209－117.892，P＜0.05）.Conclusions In Han population of Fujian，the aa genotype may be a genetic risk factor of hypertensive intracerebral hemorrhage， but there seems no correlation between 27 bp VNTR polymorphisms and large artery atherosclerosis or lacunar infarction.

Cerebrovascular disease Endothelial nitric oxide synthase Polymorphism

R743

A

2011－05－26）

（责任编辑：李 立）

☆ 福建省自然科学基金项目（编号：2010J01151）

* 福建医科大学附属第一医院神经内科 （福州 350005）

（E-mail：paulinefz＠yahoo.com.cn）