肖耀军,陈壮飞,郑少斌

(南方医科大学附属南方医院,广州 510515)

肾透明细胞癌(ccRCC)是泌尿外科较常见的一种恶性肿瘤。我们采用 60～70mer的长链寡核苷酸基因芯片,检测ccRCC组织和癌旁正常肾组织的基因表达谱,分析其基因差异表达情况,探讨肾透明细胞癌的肿瘤相关基因。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2006年2月～2007年3月本院收治的ccRCC患者4例。3例肾癌标本于肾癌根治术后0.5 h内置于液氮罐冻存备用,1例正常肾组织标本取自T1期肾癌距原发灶5 cm以上的正常区域肾组织。所有标本均经常规病理检查证实。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取、荧光标记及cDNA的合成分别取上述各组织样品50～100mg,用Trizol提取法提取总RNA,测定浓度并进行质量鉴定。用Low Input RNA Fluorescent Linear Amp lification Kit试剂盒将提取合格的RNA进行双色荧光标记。4个标本各取总RNA 2μg,按照常规逆转录方法合成cDNA。

1.2.2 荧光标记cRNA的合成与纯化 用Cy3标记肿瘤组织,Cy5标记正常肾组织,进行cRNA的合成。将cRNA样品转移到RNeasy微型纯化柱, 13 000 r/min离心30 s,弃滤液;向柱子中加500μl的RPE缓冲液,13 000 r/min离心60 s,弃滤液。将纯化柱转移到新的收集管,在纯化柱滤膜中央加入30μl的无RNA酶水,室温放置60 s,13 000 r/min离心30 s,收集到约60μl的cRNA纯化液,测定样品浓度后,-80℃遮光贮存,备芯片杂交用。

1.2.3 芯片杂交、洗片和扫描 取以Cy3及Cy5标记的线性扩增cRNA各0.75μg混合,50μl的10×对照质控样品,用去核酸酶水调至 215μl,混匀, -80℃避光保存。2×cRNA中加入9.0μl的25×片段化缓冲液,轻轻混匀,60℃避光孵育30m in后,加入 225μl的 2×杂交缓冲溶液,轻轻混匀,离心沉淀。取一新盖玻片,标签面向上置于杂交盒底座,在盖玻片上滴加400μl杂交标本,将Agilent Human 1B寡核甘酸芯片数字面向上盖在盖玻片上。……