刘春燕,马秀敏,丁剑冰,谌宏鸣

(新疆医科大学高职学院,乌鲁木齐 830006)

包虫病是棘球绦虫的幼虫寄生于人及某些动物等宿主体内所致的一种严重的人畜共患性疾病。在不同的宿主中,棘球绦虫存在着实质性的基因遗传差异,为此采用基因诊断方法具有重要的诊断价值[1]。本研究采用PCR-RFLP和微卫星DNA标记法对包虫病棘球绦虫分离株的基因型进行鉴定,希望为棘球绦虫的实验室诊断寻找一种快速有效分子生物学检测方法。

1 材料与方法

1.1 标本来源 40个包囊标本来自 40例包虫病患者(男 22例、女 18例,年龄 18～65岁,汉族 32例、蒙古族5例、回族2例、维吾尔族1例)。无菌取囊组织,用生理盐水漂洗后加入 95%的乙醇保存,以 1个包囊为 1个分离株。

1.2 引物合成 PCR-RFLP方法：在Genebank中查询棘球绦虫线粒体DNA基因序列,根据其他研究报道的基因序列,用DNAman软件辅助设计上、下游引物。rrnl上游引物为5′-GGTTTATTTGCCCCGCATCATGC-3′,下游引物为5′-ATCACGTCAAACCATTCAAACAAGC-3′,扩增长度为561 bp。微卫星DNA标记法：参照文献和检索Genebank中棘球绦虫微卫星位点,设计棘球绦虫微卫星位点基因引物,正向引物5′端分别标记不同显色的荧光。Sea上游引物为5′-CGAAAGTGATGACAAACCAA-3′,下游引物为5′-CGTTGATGGAGATGAGGTCG-3′,扩增长度为561 bp。两组引物由日本Genosys公司合成并标记。

1.3 DNA的提取 取包虫病患者的包囊组织约25 mg,置培养皿中,漂洗 2遍后放入离心管中,严格按DNA提取试剂盒说明书操作,提取基因组DNA。

1.4 PCR扩增 PCR-RFLP方法：以棘球绦虫DNA为模板,加入引物,按常规方法扩增基因片段。扩增参数：94℃预变性2 min,94℃变性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸1min,35个循环;72℃延伸2 min。每次反应均设立不含DNA模板的阴性对照和已知棘球绦虫DNA的阳性对照。……