李 黎,周晴晴,王艳静,闫红霞,石 雨,刘喜龙,康巧珍

(郑州大学生物工程系,郑州 450001)

实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠是研究多发性硬化(MS)的经典动物模型,是由同种型、同种异型、异种型神经组织抗原诱导的中枢神经系统(CNS)白质免疫炎性脱髓鞘性疾病模型。制备EAE动物模型的方法多种多样,其中利用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)制备C57BL/6小鼠EAE模型是研究MS免疫发病机制的理想模型。C57BL/6小鼠对 MOG的敏感抗原表位是 35～55位氨基酸[1]。MOG35～55抗原肽含 21个氨基酸,分子量为2582.4道尔顿。鉴于固相合成法在合成小分子多肽方面具有快速、简便、高效等优点,2010年 9～12月,本研究选用该方法并加以改进,用以制备MOG35～55抗原肽,并以合成的多肽免疫 C57BL/6小鼠,观察其免疫原性。

1 材料与方法

1.1 实验动物、仪器、试剂 雌性C57BL/6小鼠16只,8～10周,体质量 16～18 g。高效液相色谱仪,冻干机,多肽合成仪,质谱仪。Fmoc-氨基酸,DIC, HOBt,DMAP,Wang树脂,茚三酮,哌啶,吡啶,TFA, DCM,DMF,乙腈,苯酚,KCN,无水乙醇,完全弗氏佐剂(CFA),百日咳毒素(PTX)等。

1.2 方法

1.2.1 MOG35～55的合成 采用改进的Fmoc固相法。鼠源 MOG35～55多肽含 21个氨基酸,序列为MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK。①肽链合成：采用Wang树脂[3]作为固相载体,取代值为 1.51 mmol /g。取Wang树脂0.25 g,置于多肽合成仪中,加入DMF溶胀20min,将要连接的第1个氨基酸Fmoc-Lys-OH及HOBt用少量DMF溶解,加入合成仪中,再加入DIC,混匀后置摇床振荡10min,然后加入DMAP,置摇床反应2.5 h;依次用DMF、MeOH、DCM、DMF洗涤(DMF2次,MeOH、DCM各3次,每次2 min);在接肽反应之前用含20%哌啶的DMF溶液脱保护液(20 min,2次),然后加入下一个氨基酸进行缩合。成肽反应使用缩合剂为HoBt、DIC的混合液,反应时间约 3 h。如此重复脱保护、缩合的过程依次由羧基端向氨基端方向延伸至肽链组装完毕。……