曾德贵，刘玉琴

(1.广东省深圳市慢性病防治中心，广东 深圳 518020; 2.北京大学深圳医院，广东 深圳 518048)

抗结核病药异烟肼在临床应用中可引起约20%的肺结核病患者出现肝功能变化。异烟肼进入人体后经酰胺酶催化，直接或间接生成肼(hydrazine)，肼可引起肝脏出现甘油三酯积聚、三磷酸腺苷(ATP)耗竭等毒性反应，是异烟肼致肝损伤的重要毒性代谢产物。结核杆菌对异烟肼极易产生耐药性，并且随着用药时间的延长，异烟肼血药浓度持续升高，易致结核病患者出现严重肝损伤，因此应在使用过程中进行血药浓度监测[1－2]。目前，测定异烟肼血药浓度有许多方法[3－5]，但大都存在提取率低、操作烦琐的问题。笔者对以前的方法作了综合改进，将异烟肼进行柱前衍生化，降低其极性，增强其紫外吸收，旨在建立一种灵敏度高、特异性好的反相高效液相色谱法以测定血浆中异烟肼的质量浓度。

1 仪器与试药

LC－1型高效液相色谱仪(日本岛津);TGL－16G型台式高速离心机。异烟肼标准品(美国Sigma公司，批号为22409231);异烟肼片(沈阳红旗制药有限公司，规格为100 mg/片，批号为080615);香草醛、三氯醋酸、三乙胺、磷酸二氢钾、甲醇均为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:YWG－C18柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm);预柱:YWG－C18柱(25 mm ×6 mm，5 μm);流动相:V(0.02 mol/L KH2PO4)∶V(CH3OH)=61∶39，每 500 mL流动相加入 70%(V/V)的 HClO40.2 mL 及 20%(V/V)的三乙胺 0.4 mL;检测波长:340 nm;流速:1 mL/min;进样量:20 μL。在此色谱条件下，色谱峰峰形好、分离完全，血浆中内源性物质不干扰异烟肼的测定，异烟肼衍生物保留时间为11.08 min，香草醛保留时间为8.46 min，全程测定时间约13 min，色谱见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2 标准溶液配制

准确称量异烟肼标准品10.0 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，得含异烟肼1 000 mg/L的标准贮备液。移取标准贮备液5.0 mL，稀释至10 mL，配制成500 mg/L的异烟肼标准溶液备用。

2.3 血浆样品采集与预处理

抽取健康人静脉血，经高速(3 000 r/min)离心处理10 min后，吸取血浆，于－20℃下冷冻保存，作为空白血浆样品备用。健康受试者单剂量口服异烟肼片300 mg后，在24 h内分12个时间段分别抽取静脉血5.0 mL，高速(3 000 r/min)离心10 min分离血浆，吸取血浆，于－20℃下冷冻保存，作为异烟肼血浆样本待测。取血浆样品0.25 mL，置1 mL离心试管中，加100 g/L的三氯醋酸50 μL和16 g/L的香草醛溶液40 μL，然后加甲醇至总体积为0.5 mL。将上述溶液置40℃水浴反应20 min，冷却，高速(1 000 r/min)离心5 min，吸取上清液20 μL进样，按外标法定量。

2.4 方法学考察

标准曲线建立:取空白血浆0.25 mL共6份，分别加入质量浓度为 500 mg/L 的异烟肼标准溶液 0.2，0.8，2.0，4.0，8.0，12.0 μL，再分别加入100 g/L的三氯醋酸50 μL和16 g/L的香草醛溶液40 μL，加甲醇至 0.5 mL，制成质量浓度分别为 0.2，0.8，2.0，4.0，8.0，12.0 mg/L的溶液。异烟肼血浆样本经预处理后，分别进样20 μL，测出其峰面积。将峰面积(Y)对血浆样品的质量浓度(X)进行线性回归，得回归方程 Y=2.93×105X－9.30×104，r=0.999 6(n=6)。结果表明，异烟肼质量浓度在0.2～12.0 mg/L范围内与峰面积线性关系良好，最低定量浓度为0.2 g/L。

精密度试验:按标准溶液配制方法精密配制异烟肼低、中、高3种质量浓度(0.8，4.0，12.0 mg/L)的溶液，依法进样，连续测定 5 d，由测得质量浓度计算日间精密度，并于标准曲线建立的同天测定日内精密度。结果日内精密度 RSD分别为 2.6%，2.5%，2.4%(n=6);日间精密度 RSD 分别为 3.9% ，3.7% ，4.0%(n=5)。所得 RSD均在4.0%以内，表明精密度符合要求，测定方法可靠。

稳定性试验:将含异烟肼的血浆样品置－20℃低温冰箱冷冻保存，30 d后测定含量。结果高、中、低3种质量浓度的样品含量分别为 97.56%，99.28%，98.75% ，RSD 均在 3%以内，表明异烟肼的血浆样品在－20℃低温保存条件下至少30 d内含量保持稳定。

回收率试验:依法操作，制备异烟肼低、中、高3种质量浓度(0.8，4.0，12.0 mg/L)的血浆样品，按样品预处理方法处理后，依法进样测定质量浓度，计算回收率。结果见表1。

表1 异烟肼的回收率试验结果(n=9)

2.5 异烟肼血浆浓度测定

10例男性健康受试者单剂量口服异烟肼片剂300 mg，分别在服药前及服药后的 0，0.33，0.67，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，7.00，9.00，12.00，24.00 h 经前臂静脉取血 3 ～5 mL，立即置涂有肝素的离心管中，在避光处静置10～20 min，以5 000 r/min转速离心处理10 min，分离血浆，于－20℃冰箱保存待测。受试者给药后避免剧烈运动，试验期间禁烟、酒和含咖啡因的饮料。测定过程中，每日建立一条标准曲线，同时配制高、中、低3种质量浓度的质量控制样本，每一质量浓度做双样本分析，以判断当日结果的可靠性。按血浆样品预处理方法处理并测定，10例受试者的平均血药浓度－时间曲线见图2。

图2 10例受试者用药后血浆平均药物浓度－时间曲线

2.6 药代动力学参数

将测得的浓度取均数，作为主数据通过3P97程序拟合，计算药代动力学参数，达峰时间(tmax)和峰浓度(Cmax)采用实测值，用梯形法计算0～t药－时曲线下面积(AUC0－t)和0－∞药－时曲线下面积(AUC0－∞)，以半对数作图法，由消除相末端浓度点计算半衰期(t1/2)。主要药代动力学参数见表2。

表2 异烟肼的药代动力学参数(± s，n=10)

表2 异烟肼的药代动力学参数(± s，n=10)

3 讨论

异烟肼有快代谢型和慢代谢型，因此建立快捷、高灵敏度的异烟肼血药浓度监测方法很有意义。异烟肼极性大，在血浆中浓度低，所以在文献[6]的基础上采用异烟肼与香草醛的柱前衍生化反应，生成弱极性化合物异烟肼－香草醛腙，使异烟肼极性降低，易溶于有机溶剂，紫外吸收增强，提高了检测灵敏度和专属性。采用V(KH2PO4)∶V(CH3OH)=61∶39的流动相时，色谱峰峰形好、分离完全。另外，结核病患者往往同时服用利福平、吡嗪酰胺等几种抗结核病药，因而测试易受血浆中杂质和其他抗结核病药的干扰。因此，还对利福平、吡嗪酰胺两药进行了干扰测试，在上述色谱条件下，利福平、吡嗪酰胺在340 nm波长处无吸收，对本方法无干扰。本研究为异烟肼的血药浓度监测提供了一种灵敏、准确、方便的实验方法。

[1]Dahl ML，Sjoqvist F.Pharmacogenetic methods as a complement to therapeutic monitoring ofantidipressantsand neuroleptics[J].TherDrug Monit，2000，22(1):114.

[2]Lennard L.Therapeutic drug monitoring of antimetabolic cytotoxic drugs[J].Br J Clin Pharmacol，1999，47(2):131.

[3]许赤鸣，陈 冰，王 洁，等.高效液相色谱法测定人血浆中异烟肼及乙酰异烟肼浓度[J].中国药房，2005，16(13):1 001－1 002.

[4]黎昌权.高效液相色谱法测定异烟肼注射液的含量[J].中国药业，2008，17(8):32－33.

[5]乐 江，彭仁琇，刘 娟.RP－HPLC法测定血浆中异烟肼代谢物的含量[J].中国药科大学学报，2004，35(1):47－49.

[6]雷 勇，卓海通.用柱前衍生化法测定异福酰胺片中异烟肼的血药浓度[J].中国医院药学杂志，2000，20(4):208.