巩 阳，林一帆△，王长洪，王立新，麻树人，陆宇平，高文艳，刘 杨，季 芳

胆石症是一种常见病，在我国胆总管结石的发病率较高，占全国胆结石患者的5% ～29%，平均18%［1］。目前主要采取外科手术或内科介入治疗胆总管结石，安全、有效，但术后患者结石再发几率高，约为6.4% ～18%［2］，所以胆总管结石的再发给病人带来很大的负担，如何防治胆总管结石已成为当前的热点和难点。近年来，我们通过应用加减化石利胆汤治疗胆总管结石疗效显著［3］，为进一步探讨此汤剂对成石机制的影响，我们展开以下研究。

1 材料与方法

1.1 临床资料

本组100例患者均为来自沈阳军区总医院中医科2009年9月至2010年10月的住院患者，男58例，女42例，年龄28岁至80岁，平均56岁±26岁。

1.1.1 纳入标准 (1)超声或腹部 CT、MRI、MRCP等明确诊断为胆总管结石;(2)经ERCP取石术后;(3)术前1个月内未服用利胆药物。

1.1.2 排除标准 (1)肝硬化;(2)免疫性疾病;(3)严重肾脏疾病;(4)胆道狭窄;(5)十二指肠乳头良性狭窄的患者。

1.2 材料

1.2.1 试剂 化石利胆汤药物组成:茵陈30g，威灵仙 10g，金钱草 30g，厚朴 15g，枳实 15g，栀子 10g，柴胡10g，鸡内金15g，莪术15g，均由沈阳军区总医院中药局提供，广东一方制药厂生产;焦炭酸二乙酯(DEPC)，由博尔美生物制剂公司提供;人血RNA提取试剂盒、Taq聚合酶(5U/ul)，宝生物工程(大连)有限公司;逆转录酶、核糖核酸抑制剂、DNA标记物(DL2000)、CYP7A1、B-UGT 抗体，SIGMA 公司。

1.2.2 主要仪器 －85℃型号超低温冰箱(德国Hereaus公司);PCR基因扩增仪(美国 Bio-Rad公司);紫外线投射反射照相仪与计算机图像分析系统(美国Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 分组按随机非双盲(随机号码数字表法1∶1入组) 服药组50例和对照组50例，两组病人在年龄、性别、病情、病程差异上均无统计学意义(P＞0.05)。服药组于ERCP取石术后常规给予抗炎、保肝、抑酸、抑酶等西医治疗，于术后第1d给予加减化石利胆汤100ml口服，3次/d，餐后30min服药，连续口服1个月。对照组于ERCP取石术后除上述常规西医治疗外不给予任何其他治疗，2组患者术后饮食均合理配餐，均衡膳食。

1.3.2 标本采集 2组均于患者行ERCP取石术后第1天，服药后第7天及1个月采血，常规静脉采全血2ml于含EDTA抗凝负压抽血管中，颠倒混匀保存于－70℃冰柜;且每个患者均在术后留置鼻胆管，遂在术后第1、7天留取清晨空腹时鼻胆管胆汁，去除被血液污染或呈明显脓性的胆汁标本，于－20℃冰箱保存。血及胆汁中指标的检测均在沈阳药科大学生命科学与生物制药学院完成。

1.3.3 血mRNA检测 Trizol方法提取血液白细胞中总 RNA，反转录合成 cDNA，配制反应体系:MgCl2(25mM)6μl，10 × RNA PCR Buffer 8μl，灭菌蒸馏水 63.5μl，TaKaRa Taq(5U/μl)0.5μl，上游PCR引物1μl，下游 PCR 引物 1μl。引物序列为:人胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(bilirubin UDP-glucronosyltransferase，B-UGT):上 游 引 物 5'-GAATTTGAAGCCTACATTAATGCTTCTGGAGAACAT-3'和下游引物5'-TCACATCTGTCTTCCTGACTGC-3'，引物扩增产物为546bp片段;人胆固醇7α羟化酶(CYP7A1)，上 游 引 物 5’F-GCCCAACTAG AGAATCTCTG -3'和下游 引物 5'FAGATGTACAACATCTCATTC-3'。GAPDH:上 游 引物5'-TATTGGGCGCCTGGTCACCA-3'和下游引物5'-CCACCTTCTTGATGTCATCA-3'，引物扩增产物为726bp片段。

把上述80ul反应液加入到20μl反转录结束后的PCR反应管中，轻轻混匀，按以下条件进行PCR反应:变性 94℃ 30sec，退火 48℃ 30sec，延长 72℃1.5min，30个循环。PCR产物在含0.5mg/L EB的1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统作密度分析，目的基因的表达通过GAPDH的表达量作标准化处理，即半定量，然后计算各标本目的基因表达半定量的比值，各标本重复3次取均值。

1.3.4 Western blot检测蛋白表达 细胞收集于EP管中，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂，超声破碎细胞，离心后提取蛋白，考马斯亮蓝法测蛋白浓度，蛋白上样量为80μg，体系为20μl。配制12%聚丙烯酰胺凝胶，煮样后电泳、转膜、封闭(5%脱脂牛奶)，一抗4℃孵育过夜(CYP7A1为1∶500稀释，B-UGT为1∶500稀释)，洗膜45min，加入过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2h后electrochemiluminescence(ECL)发光，应用Metamorph软件计算光密度值。将每组服药前空白组的光密度值设为参考值，将其他组的光密度值与其相比得到的比值，即半定量，各标本重复3次，取均值。

1.4 统计学方法

以第三方盲态评价法，数据以珋x±s表示，采用SPSS 15.0统计软件，χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 人血CYP7A1、B-UGT mRNA表达变化

比较2组治疗前 CYP7A1、B-UGT的 mRNA表达，无明显统计学差异(P＞0.05)。服药组服药后第7天、1个月 CYP7A1、B-UGT的 mRNA表达明显强于服药前，明显强于同一时期对照组(P＜0.05，表1图 1、2)，而对照组服药前后 CYP7A1、B-UGT mRNA的表达无差异。

2.2 人胆汁中CYP7A1、B-UGT蛋白表达变化

比较2组治疗前CYP7A1、B-UGT的蛋白表达，无明显统计学差异(P＞0.05)。服药组服药后第7d CYP7A1、B-UGT的蛋白表达明显强于服药前，明显强于同一时期的对照组(P＜0.05，表2图3、4)，对照组服药前后胆汁中的 CYP7A1、B-UGT的蛋白表达无差异。

表1 不同时期两组病人血中CYP7A1、B-UGTm RNA表达

3 讨论

图1 血B-UGT m RNA表达变化

图2 血CYP7A1 m RNA表达变化

表2 不同时期两组病人胆汁CYP7A1、B-UGT蛋白表达

胆结石按成石部位分类，可分为胆囊结石、肝内胆管结石、胆总管结石，其中胆总管结石的治疗主要以ERCP等内镜介入治疗为主，且取石的成功率也越来越高，但胆总管结石的复发问题仍是难点，目前能够防石、溶石的西药的报道主要为去氧胆酸等一类药物，但因其价格昂贵，疗效不明确，应用受限。

中医药治疗胆石症历史悠久，且疗效显著，近年来中医药学者结合现代医学技术对多种中药给予深入研究。如有文献报道中药升清胶囊可以干预大鼠肝组织中成石基因，即 B-UGTmRNA 和CYP7AlmRNA的表达，进一步干预胆红素和胆固醇代谢，抑制致石性胆汁形成，起到预防胆结石的作用［4］。但中医药对于胆石症的成石基因研究只有动物实验，无临床实验研究，且尚无从胆汁或血液研究成石基因及其蛋白的表达。所以本课题从分子生物学方面研究加减化石利胆汤防治胆总管结石的机制，以便更好地指导预防工作。

胆结石的形成过程中，胆红素和胆固醇为重要的成石物质，因为它们分别是胆红素和胆固醇代谢过程中重要的酶，B-UGT和 CYP7A1mRNA为2个重要的成石基因。胆结石根据形成的主要成分，可分为胆红素结石、胆固醇结石、混合型结石。胆红素结石的主要成分是游离胆红素，所以游离型胆红素对成石有重要意义［5］，而游离胆红素是结合胆红素水解后形成的，这个水解的过程主要依靠葡萄糖醛酸基转移酶(B-UGT)，所以胆汁中游离胆红素的含量与B-UGT密切相关，于是 B-UGT的 mRNA表达水平可反映胆红素结石的形成趋势［6］。胆固醇结石中的主要物质是胆固醇，内源性的胆固醇代谢主要通过经典途径被代谢成胆汁酸，胆固醇7α羟化酶(CYP7A1)即是经典途径的起始酶，所以CYP7A1的活性代表着机体清除胆固醇的能力，也是胆固醇结石形成中重要的成石因素［7］。所以，监测 B-UGT和CYP7A1mRNA的表达和蛋白表达，可以在很大程度上说明胆石成石趋势。

图3 胆汁B-UGT蛋白表达变化

图4 胆汁CYP7A1蛋白表达变化

本课题组长期以来从事ERCP结合中医药治疗胆总管结石的研究，其病例近2000人。10余年来，我们在临床观察中发现，口服化石利胆汤可以治疗胆总管结石，且本实验证实了口服化石利胆汤的患者血中B-UGT和CYP7A1的mRNA表达及胆汁中B-UGT和CYP7A1的蛋白表达明显高于空白对照组，从而表明化石利胆汤很可能通过上调B-UGT和CYP7A1基因表达，使B-UGT和CYP7A1的蛋白表达增加，以减少结石形成。中药对于胆总管结石进一步预防的研究，应继续进行长期的药物临床观察，并对照相关胆石成石基因表达，选取有效的胆总管结石中药。

［1］ 陈希纲，刘家奇，彭民浩，等.胆石病临床流行病学调查—附8585 例分析［J］.中华普通外科杂志，2002，17(2):99-101.

［2］ Uchiyama K，Onishi H，Tani M，et al.Long-term prognosis after treatment of patients with choledocholithiasis［J］.Ann Surg，2003，238(1):97-102.

［3］ 巩 阳，林一帆，麻树人，等.耳针加化石利胆汤网篮取石术综合治疗胆总管结石的临床研究［J］.中国中西医结合消化杂志，2010，18(4):267-270.

［4］ 朱培庭，张静拮，章学林，等.升清胶囊对豚鼠胆石病相关基因的影响［J］.中西医结合学报，2005，5(3):207-210.

［5］ 吴阶平，裘法祖主编.黄家驷外科学［M］.第6版.北京:人民卫生出版社，2002:1282.

［6］ 杨文奇，祝学光，张红军，等.肝脏胆红素葡萄糖醛酸化障碍对胆石形成的作用［J］.中华消化杂志，1999，19(1):67-68.

［7］ Rudllng M.Hepatic mRNA levels for the LDL receptor and HMG—COA reductase show coordinate regulation in vivo［J］.J Lipid Res，1992，33(4):493-501.