马 颖,何援利

（南方医科大学珠江医院妇产科,广州510280）

子宫内膜异位症（endometriosis,EMs）是育龄期妇女的多发病,主要表现为痛经及不孕,危害严重。EMs虽是一种良性病,却具有易增生、浸润和复发的恶性特点,目前治疗效果有限[1-2]。有研究提示EMs与血管生成关系密切,抑制血管生成可以达到抑制病灶生长的目的。内皮抑素（endostatin,ES）是一种强效的抗血管生成物质,可诱导血管内皮细胞凋亡,但ES蛋白不稳定,需借助基因治疗发挥作用[3-4]。血管内皮细胞生长因子（VEGF）可抑制ES诱导的血管内皮细胞凋亡。为探讨血管生成在EMs中的作用,本研究构建了携带ES基因的重组腺病毒,体外感染脐静脉内皮细胞ECV-304并诱导其凋亡,同时观察VEGF对这一现象的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 Pshuttle-ES质粒由本科保存。大肠杆菌BJ5183、AAV293细胞株、ECV-304细胞由中山大学生命科学院提供。腺病毒AdEasy-1系统,包括骨架质粒pAdEasy-1及穿梭质粒pAdT rack-CMV。限制性内切酶PmeⅠ、PacⅠ为NEB公司产品；蛋白酶K为Sigma公司产品；质粒抽提试剂、DNA胶回收试剂盒为Omega公司产品；Trizol试剂盒、LipofectAMINE2000、DM EM培养基、RPM I-1640培养基为Gibco公司产品；Taq DNA聚合酶、T4DNA Ligase、限制性内切酶KpnⅠ、XbaⅠ为TaKaRa公司产品；鼠抗人内皮抑素单克隆抗体为Oncogene公司产品、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗小鼠IgG为中北京山生物工程公司产品。DNA序列测定由中山大学生命科学院测序中心完成。

1.2 方法

1.2.1 重组腺病毒Ad-ES的构建、包装、纯化、滴度及感染效率测定 以Pshuttle-ES质粒为模板,PCR扩增出ES片断（约650bp）,构建重组穿梭质粒pAdTrack-ES,在大肠杆菌BJ5183中构建重组腺病毒质粒pAd-ES。同法,制备出无外源基因插入的空载质粒pAd-T rack。pAd-ES转染85%～90%融合的AAV293细胞,约14d后收集细胞,-80℃、37℃反复冻融,收集腺病毒Ad-ES,经用氯化铯密度梯度离心纯化。……