陈佐伟,甘志彪,郭一玲,张英男

(深圳市人民医院核医学科,广东深圳518020)

1971年,Folkman提出“肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成”的观点[1]。该观点认为任何实体瘤的生长与转移均有赖于新生的血管形成(angiogenesis),缺乏新的血管形成,肿瘤的生长很难超过3 mm,只有新的血管形成后,肿瘤才能迅速增长。临床上也发现肿瘤的新生血管密度与癌转移及患者的存活率相关[2]。于是,抗血管形成为治疗肿瘤的一种新概念。

肿瘤血管生成被各种蛋白分子调控,其中包括整合素α vβ3受体。整合素α vβ3受体主要介导细胞与细胞以及细胞与细胞外基质(extrocellural matrix,ECM)之间的相互黏附,对细胞的增值、分化、转移、凋亡起到重要的调节作用,对肿瘤的侵润、转移发挥重要作用[3]。整合素α vβ3受体在肿瘤生长和转移过程中的高度限制表达,使其成为一个非常有吸引力的靶点,用于肿瘤的诊断和治疗。

1 整合素α vβ3受体

整合素α vβ3是一种ECM黏附受体,作为黏附家族中的一员,它是由由α V亚基(CD51,150 kD)和β3亚基(CD61,105 kD)形成的跨膜异源二聚体糖蛋白,又名VN(vitronectin,VN)受体。整合素由较长的胞外区、单螺旋的跨膜区及较短的胞质区三部分组成;胞质区与细胞骨架结合,将细胞骨架锚定于细胞膜,介导细胞与ECM的双向信号传递。在哺乳动物中,已经发现了18种不同的α链和8种不同的β链,二者组配形成至少24种不同的整合素受体[4]。整合素α vβ3介导细胞和ECM、细胞与细胞间的黏附和整合细胞内外信息传递。生理情况下整合素为细胞非组成性表达,在整合素家族中各亚型的表达有时序性和分布特异性。整合素α vβ3亚型是最广泛的ECM受体,主要介导间质细胞与纤维连接蛋白、纤维蛋白原、Ⅰ型胶原、玻璃黏结蛋白、层黏蛋白、Ⅷ因子相关抗原(von Willebrand factor,vWF)等ECM的黏附,并和血小板衍生的生长因子(platet derived growth factor,PDGF)、转化生长因子β1(transfor-mation growth factor,TGF-β1)、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)等细胞因子有信号协同作用,主要传递和细胞增殖、分化、运动、分布、定居、生存或凋亡等有关的细胞信号[3]。整合素不仅是细胞间的粘附蛋白,亦与细胞内的骨架相联合,并充当细胞内向外及细胞外向内的信使,对细胞的功能具有重要影响。

α Vβ3可以表达于多种细胞类型,并与多细胞活动过程中的多种配体结合,参与肿瘤的血管生成,侵袭转移、炎症、伤口愈合和凝血等生理和病理过程[5]。其中,血管生成是一种复杂的、多步骤的过程,需要许多因子间的相互作用,这些作用需要以特定的时-空方式相互协调,目前至少有8种的整合素(α 1β1、α 2β1、α 3β1 、α 6β1、α 6β4 、α 5β1、α v β3、α v β5)参 与肿瘤 血管生成,其中α Vβ3发挥着重要作用,其可能机制如下:参与内皮细胞的激活和迁移、介导内皮细胞增殖、抑制内皮细胞凋亡、参与bFGF诱导的血管生成、参与VEGF诱导的血管生成、诱导环加氧酶的产生等[6,7,8]。

2 整合素α vβ3受体肿瘤显像

受体显像是利用放射性核素标记的配体或配体类似物作为显像剂,将配体受体结合的高特异性与放射性探测的高敏感性相结合建立的一种核医学显像技术。对肿瘤的定性、定位诊断价值日益受到临床的关注。目前研究最多且最广泛用于临床的主要有131I(123I)-MIBG肾上腺素能受体显像和111In-octreotide(奥曲肽)生长抑素受体显像。其中,生长抑素受体显像剂111In-octreotide已得到欧美国家正式批准应用于临床,并在肿瘤的早期诊断与鉴别诊断、临床分期与治疗方案制定等方面起到了重要的作用[9]。然而,由于并非所有的实体肿瘤细胞都表达这两类受体,故在肿瘤临床应用中受到了一定的限制。因此,寻找肿瘤组织共同、特异和过度表达的受体,筛选与合成受体的特异性配体,并实现保留配体结合活性的放射性核素标记一直是肿瘤受体显像研究的热点。实验研究发现,整合素α V β3受体是极有应用前景的肿瘤靶受体。

整合素α Vβ3受体不仅在包括骨肉瘤、成神经细胞瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤及浸润性黑色素瘤等多种肿瘤细胞表面有高表达,而且在肿瘤组织新生血管内皮细胞膜有强烈表达,但在成熟血管内皮细胞和绝大多数正常器官系统中,α Vβ3受体表达缺乏或几乎不能被探及[10]。α Vβ3受体通过与ECM蛋白(如玻基结合素等)的受体识别序列 RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)特异性结合,介导肿瘤细胞粘附和移行,在肿瘤生长、局部浸润、转移,特别是肿瘤诱导的血管生成过程中发挥重要作用[5]。这一理论为设计含有RGD序列的α Vβ3受体小分子拮抗肽、用作选择性肿瘤靶向受体显像奠定了理论基础。

利用RGD与integrinα vβ3的特异性结合而设计的 RGD类分子探针得到广泛的研究和应用,有许多综述文章对此进行了详尽的报道。由于核医学的SPECT和PET分子显像技术更为成熟,因此在这些RGD多肽分子探针当中,放射性核素标记占据了主导地位。在制备RGD放射性标记肽中,含R GD序列肽的高亲和性(如c(RGDyK))、定位特异性、靶向多价性(如RGD二聚体肽[c(RGDyK)2])、合适的修饰(如DKCK侧链、SAA 基团的引入,以及 DOTA、DTPA、HYNIC、HPMA 的共聚连接等)以增加分子的渗透性、体内稳定性、增加肿瘤的摄取并延长其滞留时间、减少本底及非靶器官(特别是血液和肌肉)的摄入、加快血液的清除、减少肝及肾放射性聚集、利于金属放射性核素的标记、提高图像质量。这些一直是研究者困扰的问题。同时,研究用125I、99mTc、111In或18F等标记进行肿瘤显像,是目前肿瘤分子核医学中α vβ3受体显像应用研究的主要内容。实现α v β3受体的配体一步法标记药盒的制备以进行受体显像,并向临床推广应用,是本研究领域的发展方向之一。国内外学者均在该领域进行了大量的研究与探索。

国内李前伟[11]、刘开元[12,13]、胡四龙[14]等在放射性核素标记RGD多肽类似物及含RGD序列的多肽并进行受体显像方面做了大量的工作且取得较好的成果。刘开元、李前伟认为目前国外RGD肽99mTc标记报道多为引入修饰基团进行间接法标记,制备过程复杂,标记产率低,而他们利用99mTc直接标记RGD-4CK,该法简便、快速、高效,国内外报道少见。由于双环状RGD-4CK含2个二硫键,因此他们初步研究了利用酒石酸亚锡作为还原剂对RGD-4CK进行预锡化直接法标记的方法。该法标记率可达92%-95%,标记物体外稳定性好,能满足显像要求。该研究为今后其他含二硫键环形多肽的99mTc直接法标记奠定了基础[12]。我科及吉林大学马庆杰教授在用99mTc、111In、90Y和177Lu标记RGD多肽及评价方面正进行系统的研究工作。这些均将为今后国内开展α vβ3受体肿瘤显像的研究提供了理论与实践准备。

Sipkins等[15]在兔实验中应用表面脂双层分子被LM609(Vitaxin)修饰的包裹钆的脂粒体作为肿瘤受体靶向显像剂进行磁共振扫描(MRI),可显示在普通MRI扫描中无法显示的肿瘤血管生成的热点。Haubner[16]实验室和斯坦福大学陈小元[17]实验室在用18F和64Cu标记的R GD多肽进行PET显像方面做了大量的研究工作,Haubner等[16]研究表明18F标记含RGD序列多肽作为PET检查的显像剂可在鼠α V β3阳性的肿瘤中累积并呈剂量依赖性,能清晰辨别恶性组织和正常组织界限。美国普度大学生命学院刘爽[18]实验室在99mTc标记的RGD多肽方面进行了深入的研究;Sivolapenko[19]等1998年报道了99mTc标记含两个RGD的线性十肽对1例转移性黑色素瘤患者的显像观察,所得图像虽然显示了肿瘤的特异性结合,但发现肺和腹部存在持续高水平核素滞留。Haubner等[20]认为,导致肺部放射性增加的原因可能是该线性RGD肽对识别RGD序列的整合素亚型特异性不强所致,并选取经实验证实对α v β3受体具有高亲和力、高特异性的 RGD环形五肽-c(RGDfV)(注:c代表该五肽为环形,f代表该苯丙氨酸构象为D型),将其中第4位上的苯丙氨酸替换为酪氨酸,采用Iodogen法进行125I标记,得到125I-c(R GDy(I)V)(简称125I-P2),并研究了该标记多肽在体内外与肿瘤受体的结合特性,结果显示:c(RGDy(I)V)、c(RGDfV)抑制玻基结合素与α vβ3受体结合的Q值分别为0.031与0.033,即引入酪氨酸和碘不影响125I-P2与α v β3受体结合的高亲和力及选择性;但125I-P2血液清除快速,在观察期内骨肉瘤组织与血液的T/NT比值为2.7-7.7,表明其属于α v β3受体依赖性的农聚,该标记配体主要通过肝脏分泌;在荷瘤动物体内的放射自显影与上述结果一致,阴性对照标记肽125I-c(RADyV)在肿瘤组织则无特异浓聚。不过,该放射性标记配体主要经胆道系统排泄,限制了对肝脏与腹部肿瘤显像的临床应用。

有学者报道了放射性核素111In和(或)99mTc标记包括DTPA(二乙三胺五乙酸)RGD类似物、含2个RGD序列的十二肽、环形RGDfK多肽类似物及含R GD序列的多肽2葡聚糖共轭物等在内的多种α v β3受体拮抗剂[21]。资料显示,这些标记配体从血液中清除迅速,由于在拮抗剂中引入了常用的双功能连接剂如DTPA、DOTA(1,4,7,102四氮杂十二环烷四乙酸)、HYNIC(肼基烟酰胺)及葡聚糖等基团,一方面有利于金属放射性核素的标记,使部分标记配体的放射化学产率＞90%,个别可达99%;另一方面引入有上述基团的 R GD多肽主要从肾脏排泄,能加速组织本底放射性的降低,提高显像图像质量,显著扩大了这类标记配体的临床应用范围和价值。另外,所有标记化合物均在体内、外显示与肿瘤特异性结合,且在荷瘤动物体内的T/NT比值为4.0-43.0。Haubner等[15]在环形(-R GD-D-FK-)五肽中引入一个血清样淀粉蛋白(SSA)基团,得到了环形-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys-(SAA)-,简称Galacto-RGD。引入SAA后,一方面改进了RGD类似物的药物动力学,使其亲水性增加,同时明显降低肝脏的摄取;另一方面有利于实现18F的标记。体内、外受体介导结合特性、生物学分布及肿瘤鼠模型PET显像研究显示,18F-Galacto-RGD的血液清除同样快速,主要经肾脏排泄,绝大部分器官(特别是血液和肌肉)仅有低水平的放射性分布,而在观察期间α vβ3阳性肿瘤有稳定的核素浓聚,注射后120 min,肿瘤/血液比值为27.5,肿瘤/肌肉比值为10.2,表明该标记配体与肿瘤α vβ3受体特异性结合。Amitava等[22]用99mTc标记了由甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)与双环形RGD肽R GD4C(KACDCR GDCFCG)结合成的共聚体HPMA-RGD4C,并进行了前列腺癌肿瘤鼠显像,结果显示24 h甚至72 h肿瘤仍有明显放射性滞留,24 h瘤/血比值约为20,72 h瘤/血比值约为50,但肝胆和肾放射性仍明显;同时与阴性对照肽HPMA-RGE4C进行了对比,后者无明显肿瘤放射性摄取,提示前者与肿瘤的结合具有结构依赖性。陈小元等[23]在亲和性较高的c(RGDyK)肽上连接了甲氧基聚乙二醇(mPEG),用125I标记,并对皮下及常位胶质瘤进行了放射性自显影,与125I-c(R GDyK)相比,在2 h的观察时间内,前者血液清除更为迅速,肝、肾放射性聚集明显减少,但肿瘤放射性摄取峰值出现较晚。

总之,含RGD序列的小分子肽多是肿瘤α vβ3受体强有力的拮抗剂,向多肽中引入不同的功能基团进行一定修饰,并用放射性核素标记,由于未改变这类多肽的空间结构,因此并不影响标记配体在体内、外与α v β3受体结合的亲和力与选择性。这类多肽不仅是具有潜在临床应用价值的肿瘤受体靶向显像剂,而且为进一步开展实体肿瘤受体靶向核素治疗研究奠定了坚实的基础。α vβ3受体显像具有如下的应用前景:能客观地预测肿瘤对α vβ3受体拮抗剂(抗肿瘤血管生成)本身及(或)其介导的放射性核素治疗的有效性,特别有助于患者治疗方案的选择;对抗肿瘤血管生成药物的药理研究有重要的指导作用;可对实体肿瘤提供高敏感性和高特异性的定性、定位诊断,明显优于肿瘤放射免疫显像,理论上敏感性高于生长抑素受体、肾上腺素能受体和血管活性肠肽等受体显像[13]。

3 小结

恶性肿瘤的持续生长、侵袭转移与肿瘤血管生成密切相关,在这个过程中整合素α vβ3受体起着重要的作用。因此,放射性标记RGD肽作为高特异性的标记物对恶性肿瘤进行核医学显像,能够达到早期诊断和治疗目的。随着生物学和医学的飞跃发展,特别是分子生物学的发展,分子医学应运而生,从分子水平对肿瘤进行诊断以及个体化分子治疗已经成为肿瘤诊疗发展的重要方向。作为分子医学的重要组成部分,整合素α v β3肿瘤受体显像及α vβ3受体介导的放射性核素靶向治疗必将日益受到关注。研究用125I(131I)、99mTc、111In、18F 等核素标记进行肿瘤受体显像,用131I、188Re、90Y、153Sm、89Sr等核素标记进行受体介导的肿瘤治疗,并在进一步的治疗研究中对RGD多肽分子进行改造,提高其在肿瘤的摄取,延长其在肿瘤的滞留时间,使受体介导的核素靶向治疗迈向一个新的台阶,这些均是目前肿瘤分子核医学中α vβ3受体应用研究的主要内容。并尽快从主要进行动物研究过渡到向临床推广应用,是本研究领域的发展方向之一。

[1]Folkman J.Tumor angiogenesis:therapeutic implications[J].N Engl J Med,1971,285(21):1182.

[2]Vonlaufen A,Wiedle G,Borisch B,et al.Integrinα vβ 3 Expression in Colon Carcinoma Correlates with Survival[J].Modern Pathol,2001,14(1):1126.

[3]Mizeje W,Gerald J.Role of integrins in cancer:survey of expression patterns[J].Pro Soc Exp Biol Med,1999,222(2):124.

[4]Plow EF,Haas TA,Zhang L,et al.Ligand binding to integrins[J].J Biol Chem,2000,275(29):21785.

[5]Varner AJ,Cheresh DA.Integrins and cancer[J].Curr Opin Cell Biol,1996,8(4):724.

[6]Bergers G,Brekken R,McMahon G,et al.Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis[J].Nat Cell Biol,2000,2(10):737.

[7]Napoleone Ferrara.Vascular endothelial growth factor:basic science and clinical progress[J].Endocrine Reviews,2004,25(4):581.

[8]Bao W,Stromblad S.Integrin{alpha}v-mediated inactivation of p53 controls a MEK1-dependent melanoma cell survival pathway in three-dimensional collagen.This indicates that integrin alphav-mediated inactivation of p53[J].J Cell Biol,2004,167(4):745.

[9]Janson ET,Westlin JE,Ohrvall U,et al.Nuclear localization of 111In after intravenous injection of[111In-DTPA-D-Phel]-octreotide in patients with neuroendocrine tumors[J].J Nucl Med,2000,41(9):1514.

[10]Max R,Gerritsen R R,Nooijen P T,et al.Immunohistochemical analysis of integrin alpha v beta3 expression on tumor-associated vessels of human carcinomas[J].Int J Cancer,1997,71(3):320.

[11]李前伟,郑秀海,张广运,等.125I-RGD24CY肿瘤α vβ3受体显像的实验研究[J].第三军医大学学报,2002,24(11):1340.

[12]刘开元,李前伟,刘广元.99mTc直接法标记α vβ3受体拮抗剂RGD-4CK的方法学初步研究[J].重庆医学,2005,34(8):1145.

[13]刘开元,李前伟,刘广元.放射性标记RGD肽行肿瘤α vβ3受体显像研究的进展[J].医学综述,2006,12(12):757.

[14]胡四龙,曾 骏,张莉华.荷瘤裸鼠整合素α vβ3受体显像的实验研究[J].中华核医学杂志,2006,26(3):149.

[15]Sipkins D,Cheresh D,Kazemi M,et al.Detection of tumor angiogenesis in vivo by alpha(v)beta3-targeted magnetic resonance imaging[J].Nat Med,1998,4(5):623.

[16]Haubner R,Wester HJ,Weber WA,et al.Noninvasive imaging of alph(v)beta3 integrin expression using 18F-labeled RGD-containing gly-copeptide and positron emission tomography[J].Cancer Res,2001,61(5):1781.

[17]Chen XY,Sievers E,Hou Y,et al.Integrinα vβ3 targeted imaging of lung cancer.Neoplasia,2005,(7):271.

[18]Shuang Liu.Radiolabeled Multimeric Cyclic RGD Peptides as Integrinα vβ3 Targeted Radiotracers for Tumor Imaging.Mol Pharm,2006,3(5):472.

[19]Sivolapenko GB,Skarlos D,Pectasides D,et al.Imaging of metastatic melanoma utilising a technetium-99m-labelled RGD-containing synthet-ic peptide[J].Eur J Nucl Med,1998,25(4):1383.

[20]Haubner R,Bruchertseifer F,Bock1 M,et al.Synthesis and biological evaluation of a 99mTc-labelled cyclic RGD peptide for imaging the α vβ 3 expression[J].J Nucl Med,2004,43(1):26.

[21]Su ZF,Liu G,Gupta S,et al.In vitro and in vivo evaluation of a Technetiun-99m-labeled cyclic RGD peptide as a specific markerof alpha(v)beta(3)integrin for tumor imaging[J].Bioconjug Chem,2002,13(3):561.

[22]Amitava M,JustinM,Anjan N,et al.Targeting tumor angiogenic vasculature using polymer-RGD conjugates[J].J Controlled Rel,2005,102(1):191.

[23]Chen XY,Ryan P,Anthony H,et al.Pharmacokinetics and tumor retention of 125I-labeled RGD peptide are improved by PEG ylation[J].Nucl Med Biol,2004,31(1):11.