彭艳红，张梁，丁重阳，王正祥，石贵阳

1 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122

2 江南大学生物工程学院 生物资源与生物能源研究中心，无锡 214122

麻黄碱 (Ephedrine)，化学名为1-苯基-2-甲胺基丙醇，是一种从天然植物麻黄草中分离而得到的芳香族氨基醇衍生物，其立体异构体 l-麻黄碱和 d-伪麻黄碱，分别主要用作支气管扩张剂和解充血剂，具有较强的药理作用，广泛应用于临床医疗中[1-3]。工业生产中，麻黄碱主要来源于麻黄植物直接提取和化学合成，但这两种方法分别由于存在原料来源有限、生产成本高和异构体分离困难、环境污染等问题而限制了其发展[4]。利用生物转化法制备光学纯的手性化合物具有反应条件温和，产物单一，立体选择性、区域选择性和化学选择性较高，并能完成一些化学合成难以进行的反应等优点，是大规模生产手性化合物的理想途径之一，具有巨大发展潜力[5]。

本研究室前期成功筛选得到一株能够利用 1-苯基-2-甲氨基丙酮 (1-phenyl-1-keto-2-methylamino propanone，简称MAK) 为底物专一性转化生成d-伪麻黄碱的菌株摩氏摩根菌 Morganella morganii CMCC(B)49208[1]，从中分离纯化出调控此生物转化过程的羰基还原酶 (MLDH)，并利用基因工程手段使其在大肠杆菌Escherichia coli中进行了高效的表达。但是由于羰基还原酶在催化生物转化反应时需要一定量的辅酶作为电子传递体，该酶在转化MAK为d-伪麻黄碱的过程中需要辅酶NADH来提供还原力[6-7]，如若通过外加辅酶提供则成本会大大增加，这极大地制约了其在工业上的应用。而通过大肠杆菌在同一质粒上共表达羰基还原酶基因mldh和葡萄糖脱氢酶基因gdh，由于本身MLDH酶活力不高且再生的辅酶不足等原因，导致最终产物产量并不高[8]。

枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis是目前研究较为详尽的外源基因表达宿主，其葡萄糖脱氢酶 (Glucose dehydrogenase，GDH) 可以氧化葡萄糖生成葡萄糖酸同时生成还原型的辅酶NADH (NADPH)[9-10]。利用酶耦联法可以解决生物转化制备麻黄碱的过程中辅酶的再生问题。目前，国内外对利用 B. subtilis生物转化生产d-伪麻黄碱的研究很少，未见相关报道。本研究通过构建枯草芽胞杆菌游离表达质粒pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD 转化入 B. subtilis Wb600 (蛋白酶缺陷型菌株) 中使得羰基还原酶能够在枯草芽胞杆菌中表达并通过细胞内的GDH完成辅酶的再生，而避免外源性的加入，同时对重组菌专一性转化产d-伪麻黄碱进行了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

大肠杆菌E. coli JM109、B. subtilis Wb600、大肠-枯草杆菌穿梭载体 pHY300plk由江南大学工业微生物资源和信息中心 (CICIM-CU) 提供；pET28a-mldh 由本研究室构建并保存；质粒pHY300plk-PrpsD-TrpsD、pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD及菌株B. subtilis Wb600 (pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD) 为本研究中构建。

1.1.2 培养基

LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，pH 7.0~7.2；制备固体培养基时另加入1.5%琼脂粉；121 ℃灭菌20 min。用于大肠杆菌和枯草芽胞杆菌的培养，必要时，使用前加入氨苄青霉素 (Amp) 至终浓度100 mg/L用于重组大肠杆菌的筛选，加入四环素 (Tet) 至终浓度15 mg/L用于重组枯草芽胞杆菌的筛选。

1.1.3 工具酶和试剂

溶菌酶、核糖核酸酶、蛋白酶K、Taq DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、dNTPs、T4 DNA连接酶、NADH、限制性内切酶 (XbaⅠ、KpnⅠ、BamHⅠ等)、碱性磷酸酶 (CIAP) 均购于上海生工生物工程技术服务有限公司；PCR产物纯化试剂盒、质粒 DNA小量制备试剂盒、DNA Marker λ PstⅠ购于博大泰克；胶回收试剂盒购于碧云天生物公司；四环素盐酸盐 (Tetracycline HCl) 购于北京拜尔迪生物技术有限公司；l-麻黄碱 (E) 和 d-伪麻黄碱 (PE) 化学对照品购于中国药品生物制品鉴定所；1-苯基-2-甲氨基丙酮 (MAK) 为本研究室合成；其他试剂药品皆为国产或进口的分析纯和生化试剂。

1.2 方法

1.2.1 B. subtilis Wb600染色体DNA的提取

提取方法见文献[11-12]，略有修改。

1.2.2 常规分子生物学基因操作

DNA片段胶回收、PCR产物纯化用相应的试剂盒进行。质粒DNA提取、DNA的酶切、连接、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化等常规分子操作参见文献[11-12]。

1.2.3 基因的PCR扩增

根据GenBank上的枯草芽胞杆菌168菌株 (登录号：NC_000964.3) rpsD基因的启动子和终止子的基因序列，设计引物 PrpsD_F和 PrpsD_R，TrpsD_F和 TrpsD_R，引物序列见表1，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 文中所用引物及其序列Table 1 Primers and oligonucleotides used in this study

PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min，冷却至4 ℃，结束反应。PCR产物经纯化后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.4 载体pHY300plk-PrpsD-TrpsD的构建

BamHⅠ酶切质粒 pHY300plk，纯化后在 pfu DNA聚合酶作用下72 ℃延伸10 min，补平其上的BamHⅠ位点，得到载体pHY300plk-BamHⅠ(-)。SalⅠ、BamHⅠ酶切PrpsD片段，BamHⅠ、BglⅡ酶切 TrpsD 片段后与经 SalⅠ、BglⅡ酶切的pHY300plk-BamHⅠ(-) 质粒连接转化感受态细胞E. coli JM109，利用氨苄青霉素抗性筛选出重组子酶切验证。

1.2.5 游离表达载体pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD的构建

BamHⅠ酶切质粒pET28a-mldh后回收mldh片段，与经 BamHⅠ酶切的 pHY300plk-PrpsD-TrpsD连接转化E. coli JM109，利用Amp抗性筛选出重组子酶切验证。同时，以阳性质粒为模板PCR扩增后检测。另测定PrpsD-mldh-TrpsD基因序列，以确保PCR扩增序列的准确性，序列测定由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。

1.2.6 重组菌B. subtilis Wb600(pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD) 的构建

提取质粒 pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD，参考文献[13]所述方法制备枯草杆菌化学感受态并转化B. subtilis Wb600，利用Tet (15 mg/L) 抗性筛选重组子，提取阳性转化子质粒，以之前构建好的质粒pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD为对照，分别酶切后进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.7 细胞裂解液的制备

挑取阳性重组枯草芽胞杆菌转化子单菌落，接入含有Tet (15 mg/L) 的LB液体培养基，37 ℃、200 r/min培养12 h。次日，按接入培养基体积3%的接种量转接至含有Tet (15 mg/L) 的LB液体培养基，37 ℃、200 r/min培养12 h。离心收集菌体，用磷酸缓冲液 (0.2 mol/L KH2PO4-Na2HPO4缓冲液(pH 7.5)，以下出现磷酸缓冲液如未加说明均指该磷酸钠钾缓冲液) 洗涤 1~2次，离心后再用适量的预冷的磷酸缓冲液重悬菌体。超声波破碎10 min (工作1 s停4 s)，保持菌液始终处于低温 (0 ℃~4 ℃)。破壁后高速离心，上清液即为细胞裂解物，用于SDS-PAGE和生物转化反应检测。

1.2.8 重组菌B. subtilis Wb600(pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD) 的鉴定

挑取经 1.2.6所示方法酶切验证的阳性重组枯草芽胞杆菌转化子接种于LB液体培养基，按1.2.7的方法制备细胞裂解液，SDS-PAGE检测，电泳的方法和操作见文献[14]。同时，取重组菌菌体破碎液进行生物转化反应。反应体系为：50 µg MAK，50 µmol葡萄糖，1 µmol NADH和适量酶液共1 mL，30 ℃转化24 h。10 000 r/min离心10 min后，取上清液用于高效液相色谱法 (HPLC) 和超高效液相色谱-质谱联用法 (UPLC-MS) 检测。

高效液相色谱法 (HPLC)[6]检测条件：Hanbon Lichrospher C18柱；检测波长210 nm；流速1 mL/min；柱温40 ℃。流动相为：甲醇∶0.02 mol/L KH2PO4∶乙酸∶三乙胺=4 ∶ 96 ∶ 0.2 ∶ 0.13 (V:V:V:V)。超高效液相色谱-质谱联用法 (UPLC- MS) 检测条件：(A)色谱条件 色谱仪：Waters ACQUITY UPLC；检测器：Waters ACQUITY PDA；分析柱：ACQUITY UPLC BEH HILIC (2.1 mm×100 mm，1.7 µm)；流动相A：乙腈；流动相B：20 mmol/L醋酸铵水溶液；检测波长：200~600 nm；柱温：30 ℃；流速：0.30 mL/min；总分析时间：15 min；进样体积：1.0 µL。(B) 质谱条件 质谱系统：Waters SYNAPT MS检测仪；软件：Waters Masslynx V4.1质谱工作站；离子源：ESI电离源；电离模式：ESI+；毛细管电压：3.5 kV；锥孔电压：20 V；离子源温度：100 ℃；脱溶剂气温度：250 ℃；脱溶剂气流量：500 L/h；锥孔气流量：50 L/h；碰撞能量：6 eV；探测器电压：1 600 V；扫描m/z范围：50~500 Da；选择离子：m/z 164、m/z 166。

1.2.9 重组菌B. subtilis Wb600 (pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD) 全细胞不对称还原反应

取适量培养一定时间的重组菌湿菌体加入适量MAK及葡萄糖，用pH 7.5的磷酸缓冲液补足至1 mL，30 ℃转化24 h。10 000 r/min离心10 min，取上清用于HPLC检测。HPLC检测条件同1.2.8。

表2 液相色谱流动相梯度洗脱表Table 2 UPLC gradient table

2 结果与分析

2.1 载体pHY300plk-PrpsD-TrpsD的构建

提取阳性菌落的质粒DNA，进行SalⅠ、BglⅡ双酶切，电泳检测结果显示，酶切后出现 4.9 kb、820 bp两条带，4.9 kb正是载体 (pHY300plk) 的大小，而820 bp为目的连接片段 (PrpsD-TrpsD) 的大小，说明该质粒已同时插入PrpsD和TrpsD片段，为重组质粒pHY300plk-PrpsD-TrpsD。

2.2 游离表达载体pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD的构建

提取阳性菌落的质粒DNA进行酶切，电泳结果如图1A所示，BamHⅠ酶切后出现两条带，分别为5.7 kb和1.1 kb，5.7 kb是载体pHY300plk-PrpsDTrpsD的大小，而1.1 kb为目的片段 (mldh) 的大小，说明片段 mldh已插入质粒中；SalⅠ、BglⅡ双酶切后出现两条带，分别为4.9 kb和1.9 kb，4.9 kb为载体 pHY300plk的大小，1.9 kb为片段 PrpsD-mldh-TrpsD的大小，也说明在该阳性菌落的质粒中已插入mldh片段。同时，以阳性菌落的质粒DNA为模板，PrpsD_F和TrpsD_R为上下游引物，进行PCR扩增，电泳检测结果如图1B所示，PCR产物为 1.9 kb，这进一步证明质粒 pHY300plk-PrpsDTrpsD中已插入mldh片段。

由于采用单酶切进行连接，需进行正反接验证，查阅基因序列，片段上酶切位点均有限制，因此通过测定 PrpsD-mldh-TrpsD基因序列间接验证 mldh片段连接的正确与否。提取质粒pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD，测定该质粒上PrpsD-mldh-TrpsD基因片段的核酸序列，序列测定结果显示该 PrpsD和TrpsD序列与已报道的枯草芽胞杆菌168菌株rpsD基因的启动子和终止子的基因序列一致，同时mldh片段的连接为正向，说明该质粒已成功地正确连接上PrpsD、mldh和TrpsD片段。

图1 重组质粒pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD的琼脂糖凝胶电泳检测Fig. 1 Detection of recombinant plasmid pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD by agarose gel electrophoresis. (A) Restriction enzyme analysis of plasmid pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD. (B) PCR analysis of plasmid pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD. (C) Restriction enzyme analysis of plasmid pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD from recombinant B. subtilis Wb600. M: λ/Pst I DNA marker; 1: pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD/Sal I/Bgl II; 2: pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD/BamH I; 3: PCR amplification of PrpsD-mldh-TrpsD from plasmid pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD; 4: pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD/Sal I; 5: plasmid from recombinant B. subtilis/Sal I.

2.3 重组菌B. subtilis Wb600(pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD) 的鉴定

2.3.1 质粒的检测

提取阳性菌落的质粒DNA，SalⅠ酶切后电泳检测，结果如图1C所示，枯草芽胞杆菌重组子中含有与原转化所用质粒大小一致的质粒，初步认为该阳性重组子中已转入重组质粒 pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD。

2.3.2 SDS-PAGE检测

取重组菌菌体破碎液进行SDS-PAGE分析，结果如图2所示，重组菌B. subtilis Wb600 (pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD) 细胞中有相对分子质量约为42.5 kDa的蛋白得以表达。根据本研究室前期文献

[7]报道羰基还原酶的相对分子质量为42.5 kDa，这说明重组枯草芽胞杆菌能表达羰基还原酶。

图2 枯草芽胞杆菌Wb600及其重组菌SDS-PAGE检测Fig. 2 Detection of B. subtilis Wb600 and its recombinant strain by SDS-PAGE. 1: cell crude extract of B. subtilis Wb600; 2: cell crude extract of B. subtilis Wb600 (pHY300plk); 3: cell crude extract of B. subtilis Wb600 (pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD); M: standard protein molecular weight marker.

2.3.3 生物转化反应及检测

取重组菌菌体破碎液进行生物转化反应，反应结束后取上清液进行HPLC和UPLC-MS检测产物。HPLC检测结果如图 3所示，从图中可以看出，在重组菌转化液色谱图中有保留时间分别为29.23 min和31.43 min的峰，对照标样图谱，这两个峰分别对应MAK和d-伪麻黄碱，初步判断重组菌的生物转化液中含有d-伪麻黄碱。而33.8 min的峰在添加与不添加MAK的转化反应液中都会产生，该物质并非转化反应的副产物，而可能是细胞本身产生的某种物质。对其进行 UPLC-MS分析，初步得出其分子量为227.2，但仍未能确定是何种物质，有待进一步的研究。

为进一步确定转化产物，采用超高效液相色谱-质谱联用法(UPLC-MS)对转化液进行分析，测定转化产物的分子量，结果如图4所示。其中图A、B、C分别为MAK、l-麻黄碱和d-伪麻黄碱标准溶液的选择离子色谱-质谱图。从MAK、l-麻黄碱和d-伪麻黄碱的选择离子色谱-质谱图中，可以得到各自的母离子[M+H]+分别为164、166和166；同时在选择各自的特征离子 (146、148和148) 下，色谱图相应位置处分别有最大响应值，保留时间分别为3.56 min、7.85 min、7.98 min。通过标准溶液的液相色谱保留时间和质谱图可以用来确定转化液中的物质。图 D为重组菌转化液的选择离子色谱-质谱图。从图中可以看出，在同时选择特征离子146和148下，重组菌转化液中在保留时间分别为3.52 min和7.96 min处有最大响应值，对照标样图谱，这两个峰分别对应MAK和d-伪麻黄碱的峰，同时根据这两个峰的质谱图可知其对应的分子量分别为 163(164-1) 和165(166-1)，即为MAK和麻黄碱的分子量大小，因而可以判断重组菌的转化液中含有d-伪麻黄碱。

图3 标样和重组菌转化液的HPLC图谱Fig. 3 HPLC chromatogram of the transformation products and the standard sample. (A) HPLC chromatogram of the standard sample (l-ephedrine, MAK and d-pseudoephedrine). (B) HPLC chromatogram of the transformation products in the presence of MAK from recombinant B. subtilis. (C) HPLC chromatogram of the transformation products in the absence of MAK from recombinant B. subtilis.

图4 标样和重组菌转化液的选择离子色谱-质谱图Fig. 4 Selected ion chromatogram and mass spectrometry of the transformation products from recombinant B. subtilis and the standard sample. (A) Selected ion chromatogram (m/z146) and mass spectrometry of MAK. (B) Selected ion chromatogram (m/z148) and mass spectrometry of l-ephedrine. (C) Selected ion chromatogram (m/z148) and mass spectrometry of d-pseudoephedrine. (D) Selected ion chromatogram (m/z146+148) and mass spectrometry of the transformation products from recombinant B. subtilis.

2.4 重组菌B. subtilis Wb600(pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD) 全细胞不对称还原反应

2.4.1 菌体用量对重组菌全细胞生物转化的影响

分别取培养时间为12 h的不同量重组菌湿菌体，加入9 mg 葡萄糖和0.05 mg的MAK转化反应，HPLC分析测定，结果如图5所示。增加菌体用量，产物的产量会有不同程度的增长，其中以菌体量从0.1 g增加到0.2 g时增长幅度最大，而当菌体量大于0.2 g时，产物产量趋于稳定，这与本研究室前期研究结果相一致[6]，故选择0.2 g作为后续转化反应的菌体加入量。

图5 菌体用量对全细胞生物转化的影响Fig. 5 Effect of the amount of cell on whole-cell biotransformation.

2.4.2 葡萄糖浓度对重组菌全细胞生物转化的影响

取0.2 g培养时间为12 h的重组菌湿菌体，加入 0.05 mg MAK和不同量的葡萄糖转化反应，HPLC分析测定，结果如图6所示。在糖浓度为18 g/L时产物的产量最高。当糖浓度低于 18 g/L时，产物的量随糖浓度的升高而增加；而当糖浓度超过18 g/L后，由于高浓度的葡萄糖抑制GDH的酶活，辅酶NADH生成较少，最终导致随着糖浓度的继续增高产物产量反而降低。

2.4.3 底物MAK浓度对重组菌全细胞生物转化的影响

取0.2 g培养时间为12 h的重组菌湿菌体，加入 18 mg的葡萄糖和不同量的 MAK转化反应，HPLC分析测定，结果如图7所示。底物MAK在加入浓度为 0.4 g/L时产物的产量最高。当 MAK浓度低于0.4 g/L时，随着底物浓度的增加随之增加；而当MAK浓度高于0.4 g/L时，由于在高浓度MAK下存在底物抑制作用，酶活降低，产物产量随着底物浓度的增加反而降低。

图6 葡萄糖浓度对全细胞生物转化的影响Fig. 6 Effect of the concentration of glucose on whole-cell biotransformation.

图7 底物MAK浓度对全细胞生物转化的影响Fig. 7 Effect of the concentration of MAK on whole-cell biotransformation.

2.4.4 培养时间对重组菌全细胞生物转化的影响

取 0.2 g不同培养时间的重组菌湿菌体，加入18 mg的葡萄糖和0.4 mg的MAK转化反应，HPLC分析测定，结果如图 8所示。不同培养时间下，培养12 h其转化生成d-伪麻黄碱的产量最高。不同时间收集的菌体，细胞所处的生长周期不同，因而外源基因的表达量不同，进而影响到产物的产量。培养时间不够外源基因得不到充分表达，产物产量低；过长的培养时间则会导致细胞衰亡并产生大量毒素和次生产物导致酶活力下降而限制产量。

图8 细胞培养时间对全细胞生物转化的影响Fig. 8 Effect of culture time on whole-cell biotransformation.

2.4.5 较优条件下重组菌全细胞生物转化

取0.2 g培养时间为12 h的重组菌湿菌体，加入18 mg的葡萄糖和0.4 mg的MAK转化反应，HPLC分析测定d-伪麻黄碱的产量为97.5 mg/L，底物摩尔转化率为24.1%。

3 讨论

近些年，麻黄碱和伪麻黄碱不仅用于多种药物制剂，在国外还用于营养食品补充剂、减肥剂等，应用领域广泛，市场活跃。利用生物转化同时酶耦联再生辅酶的方法制备麻黄碱是大规模生产麻黄碱的理想途径之一，具有巨大发展潜力。枯草芽胞杆菌作为目前原核表达系统中较理想的宿主，生理、生化、遗传及分子生物学研究背景良好，与大肠杆菌表达系统相比具有以下特点：非致病性；密码子偏好型不明显，转录翻译机制清楚[15]；虽表达水平低，但避免了蛋白质的错误折叠或不完全合成和易形成包涵体的缺点[16]。近年来，随着分子生物学和基因工程的发展，枯草芽胞杆菌作为基因工程表达系统发展迅速，并展现出良好的应用前景。

本文首次报道了利用 B. subtilis生物转化生产d-伪麻黄碱，重组B. subtilis在葡萄糖存在的情况下能够催化底物MAK转化生成d-伪麻黄碱。研究选择B. subtilis Wb600作为宿主，利用强启动子PrpsD和终止子TrpsD实现mldh在枯草芽胞杆菌中的高效表达，同时通过细胞内GDH解决辅酶的再生问题。对重组菌进行全细胞转化反应实验，产物产量最高为97.5 mg/L，底物摩尔转化率为24.1%，成功实现了目标酶的生物转化功能，避免了昂贵的辅酶外源性的加入，大大降低了产物的制备成本。

本研究室前期研究中，利用 M. morganii催化MAK生产d-伪麻黄碱，通过外加辅酶，由于辅酶提供充足，最终产物产量为85.2 mg/L，摩尔转化率达84.4%[6]；而利用共表达mldh和gdh的重组大肠杆菌不对称还原产 d-伪麻黄碱，虽然实现了辅酶在细胞内的再生，但由于本身MLDH酶活力不高且再生的辅酶未能完全替代外加辅酶的作用，结果最终产物产量和摩尔转化率均不是很高，分别为 58 mg/L和 57.6%[8]；相比之下，本研究中产物产量稍有提高，但底物摩尔转化率较低。从文中葡萄糖浓度对转化的影响可知，在一定浓度范围内产物的量随糖浓度的升高而增加，但增长幅度并不大，初步判断可能是由于转化反应过程中GDH酶活力不高，虽增加葡萄糖浓度，但辅酶仍提供不足，导致最终产物产量相差不大。此外，相比外加辅酶，通过葡萄糖脱氢酶实现辅酶的再生，其在氧化葡萄糖生成辅酶的同时也存在葡萄糖酸的产生，而葡萄糖酸的产生会影响反应体系的 pH，导致反应未能在较适的 pH条件下进行，最终影响产物的产量。本研究虽然实现了mldh基因在枯草芽胞杆菌中的高效表达，在不外加辅酶的情况下可以转化生产麻黄碱，但仍未能较好地解决转化过程中辅酶的需求问题，后续可以进一步考察增加GDH拷贝数或更改MLDH与GDH两者之间的比例关系从而提高产物的产量；或通过筛选自身GDH酶活力较高的野生型菌株，以其为宿主表达羰基还原酶基因实现产物的高产。这些研究对于工业应用重组枯草芽胞杆菌生物转化生产 d-伪麻黄碱具有重要意义。

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