梁丽亚，马江锋，刘嵘明，王光明，徐冰，张敏，姜岷

南京工业大学 生物与制药工程学院 材料化学工程国家重点实验室，南京 210009

丁二酸 (又称琥珀酸)，被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品和塑料等行业，作为C4平台化合物，可用于合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS) 类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来 12种最有价值的生物炼制产品之一[1-2]。利用微生物发酵法转化可再生资源生产丁二酸，价格低廉、污染小，且在发酵过程中可吸收固定 CO2，开辟了温室气体利用的新途径，近年来成为研究的热点。

丁二酸的生产菌株很多，目前研究的热点主要集中在产琥珀酸厌氧螺菌 Anaerobiospirillum succiniciproducens[3]、产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes[4]、产琥珀酸曼氏杆菌 Mannheimia succiniciproducens[5]和重组大肠杆菌 Escherichia coli[6-7]。利用野生菌株生产丁二酸虽然获得了较高的产物浓度，但培养基成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，阻碍了其工业化进程。大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，近年来被广泛用于研究以获得产丁二酸优秀菌株。图1是大肠杆菌的厌氧混合酸发酵途径[8]。产丁二酸大肠杆菌基因改造策略主要有：增强代谢途径中的关键酶 (如PPC)、失活或敲除竞争途径中的酶 (如LDH、PFL)、引入新的代谢途径 (如乙醛酸循环) 等[9]。

图1 大肠杆菌厌氧混合酸发酵途径[8]Fig. 1 Pathways of anaerobic mixed acid fermentation for Escherichia coli[8].

大肠杆菌 NZN111由于缺乏了乳酸脱氢酶的编码基因 (ldhA) 和丙酮酸-甲酸裂解酶的编码基因(pflB) 而使副产物乳酸和甲酸的生产途径阻断，具有潜在生产丁二酸的能力。但同时由于NADH依赖的乳酸脱氢酶 (LDH) 无法合成而限制了糖酵解过程中形成的NADH再生为NAD+的过程，造成辅酶不平衡，导致该菌株厌氧条件下不能利用葡萄糖进行生长。其中 Stols和 Donnelly[10-11]将大肠杆菌中NAD+依赖的苹果酸酶过量表达于E. coli NZN111后可以进行丁二酸的厌氧发酵，初始20 g/L葡萄糖产生12.8 g/L丁二酸，转化率达到64%，本实验是通过过量表达另一个 NAD+依赖的苹果酸脱氢酶使重组菌恢复了厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，且通过测定细胞干重及辅酶NAD(H) 的含量从而验证了辅酶不平衡导致E. coli NZN111无法代谢葡萄糖的假设。Hong和Lee选择还原性糖山梨醇作为碳源，当以CO2为气相时，20 g/L山梨醇发酵产生10 g/L丁二酸，转化率达到50%[12-13]。

苹果酸脱氢酶 (MDH) 在厌氧条件下主要催化草酰乙酸 (OAA) 到苹果酸 (Malate) 的反应过程，该过程伴随着 1分子的 NADH再生为一分子的NAD+，在E. coli NZN111中过量表达该基因将有利于NADH再生为NAD+，从而维持该菌株胞内的辅酶平衡，恢复其在厌氧条件下的生长及耗糖能力，促进丁二酸的合成。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

大肠杆菌DH5α由本实验室保藏；质粒pTrc99a由南京师范大学邵蔚蓝教授惠赠；E. coli NZN111 (ldhA::Kan Pfl::cam) 由南伊利诺伊卡本代尔大学Clark教授惠赠，作为宿主菌和对照菌。

1.1.2 主要试剂

氨苄青霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素，购自上海生工生物工程有限公司；基因组提取试剂盒和琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；质粒小量快速提取试剂盒为上海申能博彩生物科技有限公司产品；DNA片段回收试剂盒、限制性内切酶、Pyrobest DNA聚合酶和T4 DNA连接酶为大连宝生物有限公司产品；酵母提取物和胰蛋白胨为 Oxoid公司产品；CO2气体购自南京上元工业气体厂；发酵罐购自美国NBS公司BIOFLO110系列7 L发酵罐。其他试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 mdh基因的克隆

引物设计：参照MDH基因序列 (来源于E. coli K12 基因组，Gene Accession No. ECK3225) 设计，由上海申能博彩生物科技有限公司合成。分别在上下游引物的 5′端引入了 EcoRⅠ和 HindⅢ限制性酶切位点 (下划线标示)，引物序列如下：Forward (5′−3′)：GGAATTC ACACATTCTTGAGATGTGGTC ATT；Reverse (5′−3′)：CCCAAGCTT AATATCCGGC AACCAATTAAGTC。PCR反应体系：上下游引物(50 pmol/μL) 各1 μL；模板DNA (100 ng/μL) 0.5 μL；l0倍缓冲液5 μL；dNTPs (10 mmol/L) 1 μL；DNA聚合酶 (2.5 U/μL) 1 μL；ddH2O 38.5 μL，总体积50 μL。反应条件：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 45 s，55 ℃45 s，72 ℃ 1 min ，35个循环；72 ℃ 10 min。

1.2.2 重组质粒的构建

将纯化后的mdh基因片段以及质粒pTrc99a进行EcoRⅠ和HindⅢ双酶切反应，把双酶切后得到的片段在T4 DNA连接酶的作用下16 ℃连接过夜，构建重组质粒pTrc99a-mdh并转化于E. coli NZN111中。涂布含氯霉素、硫酸卡那霉素和氨苄青霉素平板后挑选抗性克隆，提取质粒后进行HindⅢ单酶切及EcoRⅠ和HindⅢ的双酶切鉴定。

1.2.3 重组苹果酸脱氢酶的诱导表达

菌体转化：CaCl2法[14]。有氧诱导：37 ℃、200 r/min培养菌体到OD600约0.6左右，加入IPTG至终浓度为0.3 mmol/L，30 ℃、170 r/min诱导8 h。

1.2.4 酶活检测

样品处理：采取超3 s停5 s的策略共超声破碎3 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清即粗酶液，测定酶活并进行SDS-PAGE分析。

总蛋白浓度测定按照 Bradford法[15]，以 BSA (牛血清白蛋白) 为标准。

标准反应体系如下[16]：0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.8)，0.2 mmol/L的NADH，2 mmol/L的草酰乙酸。30 ℃连续监测340 nm处吸光值的变化，根据测定的标准曲线换算成底物浓度。

酶活定义为：30 ℃时1 min内催化1 μmol的草酰乙酸转化为苹果酸所需要的酶量，即1 U。比酶活定义为每毫克蛋白含有的酶活 (U/mg)。

1.2.5 辅酶NADH与NAD+浓度的测定

[17]方法：反应时依次添加 150 μL上述的细胞提取液、0.9 mL的纯水、1.8 mL的混合反应液 (等体积的1.0 mol/L Bicine buffer、纯乙醇、40 mmol/L EDTA、4.2 mmol/L MTT和双倍体积的16.6 mmol/L PES混合，30 ℃水浴10 min) 和150 μL的乙醇脱氢酶 (500 U/mL)，迅速混匀后，测定波长570 nm处的吸光度值A570，将A570随时间变化曲线斜率带到标准曲线，得到待测样品中NADH与NAD+的浓度。

1.2.6 培养基及培养条件

LB培养基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，pH 7.0，氯霉素、硫酸卡那霉素和氨苄青霉素的终浓度分别为25、30、100 μg/mL。

30 mL LB液体培养基，添加0.48 g碱式碳酸镁，20 g/L葡萄糖，抗生素添加同有氧培养，添加终浓度为0.3 mmol/L的诱导剂IPTG (异丙基-β-D-硫代半乳糖苷) 以诱导表达MDH。

3 L发酵液组成：LB培养基，好氧培养阶段添加抗生素浓度同上，5 mol/L NaOH外源流加调节pH值至7.0，根据需要补加葡萄糖。厌氧发酵阶段采用分批补料的方式补加葡萄糖，并加入灭过菌的碱式碳酸镁内源调节pH值为6.80。

1.2.7 培养方法

有氧摇瓶培养：将保存于−80 ℃的菌种在加有相应抗生素的平板上活化，挑单菌落到5 mL LB试管，37 ℃、200 r/min培养10 h，1%接种量接种到好氧培养基中，37 ℃、200 r/min培养6 h。

厌氧血清瓶发酵：转接 10%的菌液到血清瓶中，通入过滤除菌后的CO2气体2 min，保证血清瓶中为厌氧环境，厌氧发酵30 ℃、170 r/min，发酵周期48 h。

7 L发酵罐两阶段发酵：在发酵罐上采用的是先在有氧条件下通入无菌空气来培养菌体，37 ℃、500 r/min振荡培养，初始葡萄糖浓度为10 g/L，当葡萄糖几乎耗尽时开始以低流速2.0 g/(L·h) 流加600 g/L的葡萄糖，当OD600达到16左右时，以0.5 L/min的流速通入CO2气体，37 ℃，200 r/min，补加葡萄糖，使厌氧起始葡萄糖浓度为15 g/L左右，并加入48 g灭菌后的碱式碳酸镁。

1.2.8 发酵及代谢物分析

细胞生长是用紫外可见分光光度计于波长600 nm处测定吸光度值，细胞干重 (DCW) 是由DCW与OD600测定的标准曲线换算得到，换算公式为：DCW (g/L)=0.4×OD600。培养基中的葡萄糖用生物传感仪 (SBA40C) (生产厂家是山东省科学院生物研究所) 检测，有机酸用高效液相色谱法(HPLC) 检测，色谱柱为Prevail Organic Acid，流动相为25 mmol/L KH2PO4，pH 2.5，流速1.0 mL/min，紫外检测波长215 nm。

2 结果与分析

2.1 苹果酸脱氢酶 (MDH) 的克隆与表达

将 PCR扩增后的目的基因片段 mdh和载体pTrc99a分别进行EcoRⅠ/HindⅢ双酶切 (图2)，酶切产物纯化后用T4 DNA连接酶连接，构建表达载体pTrc99a-mdh。

图2 质粒pTrc99a和mdh的双酶切鉴定Fig. 2 Identification of pTrc99a and mdh by restriction endonuclease digestion. M: DNA marker; 1: pTrc99a digested with EcoR I and Hind III (4 125 bp); 2: mdh digested with EcoR I and Hind III (939 bp).

重组质粒经单、双酶切鉴定 (图 3)，结果与预期一致。进行测序后发现目的基因序列与公布的序列100%匹配。

2.2 MDH酶活测定

37 ℃、200 r/min培养菌体到OD600=0.6，加入IPTG至终浓度为0.3 mmol/L，30 ℃、170 r/min诱导 8 h后对出发菌株和构建的重组菌株进行粗酶液的相应酶活测定，计算出粗酶液的比酶活，结果如表1所示。

由表 1可知：重组菌苹果酸脱氢酶比酶活最高为39.84 U/mg，而对应的受体菌仅为3.112 U/mg，重组菌的比酶活提高了 11.8倍，E. coli NZN111/ pTrc99a的比酶活为3.074 U/mg，重组菌的比酶活提高了12倍，可见重组菌中的苹果酸脱氢酶基因得到了过量表达。

图3 重组质粒pTrc99a-mdh的酶切鉴定Fig. 3 Identification of pTrc99a-mdh by enzyme digestion. M: DNA marker; 1,2: pTrc99a-mdh digested with Hind III; 3,4: pTrc99a-mdh digested with EcoR I and Hind III.

2.3 厌氧摇瓶发酵

有氧培养菌液10%转接厌氧血清瓶，48 h后测定细胞干重、MDH的酶活及辅酶NAD+/NADH的量，并测定残糖及有机酸的含量。结果如表2所示。

由表 2可知，过量表达苹果酸脱氢酶恢复了厌氧条件下E. coli NZN111的生长，重组菌细胞干重是对照菌的 3.8倍，在一定程度上也恢复了出发菌株代谢葡萄糖的能力，48 h内可以消耗10 g/L的葡萄糖，产2.5 g/L的丁二酸，而对照菌几乎没有丁二酸生成。MDH比酶活提高了14.8倍。辅酶 NAD+与NADH的总量提高了2倍，NADH/NAD+的比例由0.64降低为0.30。

表1 对照菌与重组菌的蛋白浓度、MDH酶活及比酶活Table 1 Concentration of protein, enzyme activity and specific enzyme activity of MDH in the control strain and in the recombinant strain

厌氧摇瓶分别于18 h、28 h和48 h结束培养，分别测定细胞干重 (DCW)、耗糖及 NAD(H) 的含量，进而计算NADH/NAD+，结果如图4所示。

由图4可以看出18 h时重组菌E. coli NZN111/ pTrc99a-mdh与对照菌E. coli NZN111的DCW均未有所增加，两者均未耗糖，NADH/NAD+均为 0.65左右。发酵28 h和48 h后，E. coli NZN111/pTrc99amdh的DCW比对照菌分别提高了1.2倍和1.8倍，耗糖分别提高了2倍和7倍，说明过量表达苹果酸脱氢酶恢复了E. coli NZN111厌氧条件下的生长及耗糖能力。图 4C显示，28 h和 48 h时 E. coli NZN111/pTrc99a-mdh NADH/NAD+分别为 0.26和0.33，而对照菌NADH/NAD+均为0.76，说明过量表达苹果酸脱氢酶使NADH氧化为NAD+，恢复了氧化还原平衡，从而恢复了其厌氧条件下的生长及耗糖能力。

表2 厌氧血清瓶培养后各种参数的测定结果Table 2 Results of these parameters on anaerobic fermentation in sealed bottles

图4 不同时间E. coli NZN111/pTrc99a-mdh与E. coli NZN111细胞干重 (A)、耗糖 (B) 和NADH/NAD+ (C) 的比较Fig. 4 Comparision of DCW (A), consumed glucose (B) and NADH/NAD+ (C) between E. coli NZN111/pTrc99a-mdh and E. coli NZN111 at different time. DCW: dry cell weight.

2.4 两阶段发酵

有氧培养可快速提高菌体密度，从而提高发酵过程的生产强度，本研究将重组菌株先有氧培养至细胞干重达到6.4 g/L，然后通入CO2转成厌氧发酵状态，并加入终浓度为0.3 mmol/L的IPTG。每隔2小时取样测 OD600、残糖并留样测有机酸含量 (图5)。转厌氧后15 h，葡萄糖消耗为14.75 g/L，丁二酸浓度达到15.18 g/L，丁二酸的得率为1.03 g/g葡萄糖，丁二酸的生产强度为1.012 g/(L·h)。

图5 E. coli NZN111/pTrc99a-mdh在7 L发酵罐中转厌氧发酵阶段的细胞干重 (DCW)、葡萄糖及产物浓度Fig. 5 DCW, the concentrations of glucose and the organic acids in E. coli NZN111/pTrc99a-mdh after transition to anaerobic-phase fermentation in a 7 L fermentor. DCW: dry cell weight.

3 讨论

本研究构建了重组大肠杆菌 NZN111/pTrc99amdh，有氧诱导时比酶活比对照菌提高了 11.8倍。厌氧摇瓶发酵过程中通过添加终浓度为0.3 mmol/L的 IPTG诱导使苹果酸脱氢酶在大肠杆菌 NZN111胞内得到过量表达，苹果酸脱氢酶 (MDH) 酶活较对照菌提高了14.8倍，NADH/NAD+的比例从0.64减少到0.26，同时NADH与NAD+的总量提高了2倍，恢复了厌氧条件下E. coli NZN111的生长及耗糖能力。通过两阶段发酵，厌氧发酵阶段，15 h内葡萄糖消耗为14.75 g/L，丁二酸浓度达到15.18 g/L，丁二酸的得率为1.03 g/g葡萄糖，丁二酸的生产强度为1.012 g/(L·h)。与国内外有关大肠杆菌NZN111研究报道的发酵结果相比，通过过量表达苹果酸脱氢酶后进行两阶段发酵，丁二酸的得率及丁二酸的生产强度都有很大提高，为丁二酸的工业化生产提供了一个新的平台。

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