刘秀颖，何秀萍，卢莹，张博润

1 中国科学院微生物研究所 酵母菌分子遗传与育种实验室，北京 100101

2 中国科学院研究生院，北京 100049

燃料乙醇作为一种清洁能源得到了越来越广泛的关注。酵母菌，尤其酿酒酵母，是以糖质和淀粉质为原料的乙醇发酵最经典的菌株。野生酵母菌的最适生长和发酵温度通常在30 ℃左右，而在工业发酵过程中常常面临由地区或季节影响以及发酵过程本身释放的大量热量造成的高温胁迫，因此温度变化胁迫是影响酵母发酵效率的一个重要限制因素。提高酵母菌的热耐受性以及高温胁迫条件下的发酵性能，不但对乙醇发酵工业有重要意义，同时也将极大提高以酵母菌为发酵主体的其他发酵工业的生产效率。

酵母菌的热耐受性一直是酵母菌研究和发酵工业生产的热点问题。研究人员不断尝试各种不同的方法和策略来实现对酵母菌耐热性能的改造[1]。其中，Banat等从印度样品中分离到能在45 ℃发酵葡萄糖的耐高温酵母菌株[2]。Edgardo等通过温度适应性驯化使酵母菌株的最高生长温度提高了 3 ℃[3]。Shimoda等建立了利用缺失校正功能的DNA聚合酶δ为诱变因子的温度适应性驯化策略[4]。Sakanaka等将一株耐高温的克鲁维酵母和高产乙醇的酿酒酵母进行融合，获得了可以在43 ℃生长的融合菌株，但该菌株丧失了高温发酵能力[5]。随着对酵母菌耐热机制理解的不断加深，通过对酵母菌热耐受性相关基因的操作来定向改造酵母耐高温性能成为可能。Hiroyuki等通过过表达泛素连接酶 Rsp5和多个泛素结合酶提高了野生酵母菌株CKY8的多种胁迫耐受性，获得在 39 ℃的热耐受性明显提高的重组菌株[6]。但由于酵母热耐受性调控网络和各菌株遗传背景的复杂性，仅对单个或少数基因的功能进行调控，还难以获得理想的效果。而经典的、基于全细胞遗传信息重组的策略对于受复杂机制调控的生理性能的改造仍然是一个重要的选择。本研究采用化学诱变和基于基因组 DNA诱变的遗传重组方法对乙醇工业酵母菌株进行耐热性能改造，获得一株耐热性能和发酵性能提高的重组酿酒酵母菌株，为酿酒酵母在燃料乙醇高温发酵方面的应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CE1~CE8均为本实验室保存的乙醇工业酵母。

1.1.2 培养基和实验试剂

酵母菌常规培养使用YEPD培养基，配方如下(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，自然pH。乙醇发酵使用EFM培养基，配方如下 (g/L)：酵母粉6，蛋白胨10，尿素5，磷酸二氢钾1，水合硫酸镁1.5，氯化钙0.55，葡萄糖200，自然pH。

使用的其他化学试剂包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸二乙酯、硫代硫酸钠以及山梨醇等均购自北京化学试剂公司。

1.2 方法

1.2.1 化学诱变

培养至对数中期的酵母细胞，3 000×g离心5 min收集菌体，用0.2 mol/L磷酸缓冲液 (PB，pH 5.8) 洗 2次，细胞重悬于等体积的磷酸缓冲液中，加入1% (V/V) 的DES (硫酸二乙酯)，30 ℃、200 r/min条件下培养 40 min，加入10倍体积的5%硫代硫酸钠终止反应。诱变菌液进行梯度稀释后，涂布在YEPD平板上，分别在42 ℃和43 ℃培养48 h[7]。

1.2.2 酵母菌总DNA的提取和遗传转化

酵母菌总DNA的提取参照文献[8]进行。酵母菌的遗传转化参见文献[9]的电击转化法，略有改动。将YEPD液体培养基中活化的酵母菌以1%的接种量转接到5 mL YEPD液体培养基中，30 ℃，200 r/min条件下培养至OD600值达到1.3~1.6。4 ℃、5 000×g离心3 min收集菌体。细胞用预冷的无菌双蒸水和1 mol/L山梨醇溶液洗2次，4 ℃、5 000×g离心3 min收集菌体。细胞重悬于50 μL预冷的山梨醇溶液中，置于冰上备用。取40 μL上述菌液与待转化DNA混合后移入0.2 cm电转化杯中，冰浴5 min，在 1.5 kV电压下，电击 5 ms (BIO-RAD micropulser)。电击后立即加入0.5 mL山梨醇溶液，轻轻混匀后，转移到1.5 mL离心管中，加入0.5 mL YEPD液体培养基，30 ℃静置孵育2 h，然后5 000×g离心3 min收集菌体，无菌水洗1次后，细胞重新悬浮于无菌水中，均匀涂布在YEPD平板上。

1.2.3 基因组DNA诱变及遗传重组

不同菌株来源的总 DNA等量混合，加入 1% (V/V) 的DES (硫酸二乙酯)，37 ℃温育1 h，然后通过电击转化法转化酵母菌，转化液涂布在含1 mol/L山梨醇的YEPD平板上，分别在43 ℃和44 ℃培养3~5 d，检测不同单菌落的耐热性。

1.2.4 酵母细胞的温度适应性分析

培养至对数中期的酵母细胞进行梯度稀释，稀释度为 10−1、10−2、10−3、10−4的菌悬液点于 YEPD平板上，在不同温度下培养48 h，检测酵母细胞对不同温度胁迫的适应能力。为了分析酵母细胞对热激的耐受性，3 000× g离心5 min收集对数中期的酵母细胞，细胞重悬于等体积新鲜YEPD中，分别在48 ℃和52 ℃处理，不同时间取出100 μL菌液，梯度稀释后涂布于YEPD平板上，30 ℃培养48 h，单菌落计数后，以0 h为对照，计算其在热激不同时间后的存活率 (%)，来表征菌株的热激耐受性。

1.2.5 酵母菌株遗传稳定性分析

酵母菌遗传稳定性分析按文献[10]方法进行。将重组菌株在10 mL YEPD液体培养基中连续传代10次，培养条件为30 ℃、24 h。将传代10次后的菌液适当稀释，在YEPD平板上划线，挑取约50个单菌落，在无菌水中饥饿4 h。将饥饿过的单菌落点于YEPD平板上，分别在44 ℃和45 ℃培养48 h，观察并对比菌落生长情况。

1.2.6 乙醇发酵

将 YEPD斜面上活化的酵母菌株接种于 2 mL YEPD液体培养基中，在30 ℃、200 r/min条件下培养16 h，转接到10 mL YEPD液体培养基中，在30 ℃、200 r/min条件下培养18 h，然后转接到100 mL EFM培养基中，分别在30 ℃、37 ℃、40 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃条件下培养6 h (150 r/min)，然后进行厌氧发酵，定时取样检测各项发酵性能指标。每个条件重复3次，每次设3个重复。

1.2.7 葡萄糖、乙醇及生物量的测定

在发酵的不同时间点取出发酵液5 mL，3 000× g离心5 min，分别收集上清液和细胞沉淀。细胞沉淀在60 ℃烘干至恒重后称重，生物量为每升发酵液中细胞的干重 (g/L)。上清液进行适当稀释，用SBA-40C型生物传感分析仪 (山东省科学院生物研究所) 测定乙醇和葡萄糖含量，单位为g/L。

2 结果与分析

2.1 原始酵母菌株的筛选

对实验室保存的乙醇工业酵母菌株 CE1~CE8的耐热性和发酵性能进行比较分析，发现这些菌株在 30 ℃时的发酵性能没有明显差异，但菌株 CE6的热耐受性较其他菌株要高，CE6的最高生长温度是41 ℃ (图1)，而其他菌株的最高生长温度均为40 ℃。因此选择菌株CE6进行进一步的耐热性能改造。

2.2 化学诱变提高乙醇酵母的耐热性

酵母菌株 CE6进行化学诱变后，菌液涂布于YEPD平板上，在42 ℃和43 ℃培养。通过耐热性比较，筛选到最高能在43 ℃生长的突变株，分析比较这些突变株在30 ℃和40 ℃条件下的乙醇发酵性能，发现这些突变株在 30 ℃时的发酵性能与 CE6相比没有明显差异，但在40 ℃发酵时，其中2个突变株的乙醇产量明显优于原始菌株 CE6，分别命名为T43-1和T43-2。

图1 原始菌株CE6在不同温度下的生长情况Fig. 1 Growth of original strain CE6 at different temperatures. Five colonies of the strain CE6 (from left to right) and serial dilution of 10−1 to 10−4 (from up to down) were spotted onto YEPD medium and cultivated at different temperature.

2.3 基于基因组 DNA诱变的遗传重组技术提高乙醇酵母的耐热性

提取突变株T43-1和T43-2的基因组DNA，等量混合后与化学诱变剂 DES温育，然后分别电击转化突变株T43-1和T43-2，比较转化菌株在不同温度条件下的生长情况，筛选到能在 44 ℃正常生长、45 ℃时生长明显受到抑制的重组菌株 (图2)。比较这些菌株在不同温度下的发酵性能 (30 ℃、40 ℃、42 ℃下发酵24 h)，发现在较高温度条件下重组菌株T44-2的乙醇产量与原始菌株CE6相比有明显提高。

图2 重组菌株与原始菌株的耐热性比较Fig. 2 Comparison of thermotolerance among recombinant strains and the original strain. 1: CE6; 2: T44-4; 3: T44-3; 4: T44-2; 5: T44-1. Serial dilution of 10−1 to 10−4 (from up to down) were spotted onto YEPD medium and cultivated at different temperatures.

重组菌株 T44-2和原始菌株 CE6在 48 ℃和52 ℃热激处理0~2 h的过程中，T44-2的细胞存活率始终高于原始菌株CE6，其中48 ℃和52 ℃热激处理1 h时，T44-2的细胞存活率分别是CE6的1.84倍和1.87倍 (图3)，说明重组菌株T44-2比CE6具有更强的热激耐受性。重组菌株T44-2在YEPD液体培养基中30 ℃传代培养10次后，所检测的单菌落均能在44 ℃正常生长，而且随机检测的10个单菌落的乙醇发酵性能指标没有明显差异，说明重组菌株T44-2是遗传稳定的。

2.4 不同温度下乙醇发酵性能分析

图3 重组菌株T44-2与原始菌株CE6在48 ℃和52 ℃的热激存活率比较Fig. 3 Comparison of survival rate of the recombinant strain T44-2 and original strain CE6 under heat shock at 48 °C and 52 °C respectively.

对不同温度下重组菌株T44-2和原始菌株CE6的乙醇发酵性能进行比较，发现在检测的温度范围内，重组菌株的产乙醇能力均高于原始菌株，而且温度越高，这种优势越明显 (图4)。在30 ℃和37 ℃条件下发酵16 h后，200 g/L的葡萄糖被消耗完，重组菌株T44-2分别产生91.2 g/L和90.3 g/L乙醇，原始菌株CE6产乙醇量分别为85.2 g/L和85.1 g/L (图4A、4B)。40 ℃发酵时，重组菌株T44-2和原始菌株CE6的发酵时间均比37 ℃发酵时延长了14 h，到30 h时乙醇产量达到最高，重组菌株T44-2基本上将200 g/L葡萄糖消耗完，产生了83.8 g/L乙醇，为37 ℃发酵时乙醇产量的92.8%，葡萄糖向乙醇转化的效率为0.42 g/g；而原始菌株CE6的糖利用率只有79%，产生了64.7 g/L乙醇，为37 ℃发酵时乙醇产量的76%，葡萄糖向乙醇转化的效率为0.41 g/g (图4C)。两株菌在42 ℃的发酵性能变化趋势基本与40 ℃条件下一致，但生长和代谢活性均有所降低。在43 ℃和44 ℃条件下，原始菌株CE6的生长及代谢活性基本停止，葡萄糖利用率只有7.5%和7%，只有极少量乙醇产生；而重组菌株T44-2发酵36 h后糖利用率分别为 80.4%和 63.5%，分别产生了69.2 g/L 和52.6 g/L乙醇，分别是37 ℃发酵时乙醇产量的76.6%和58.3% (图4E、4F)。上述结果表明重组菌株 T44-2不但对高温具有良好的耐受性，其发酵活性也具有比较广泛的温度适应性，在30 ℃~ 40 ℃范围内均具有良好的糖醇转化率和乙醇产量。

2.5 不同温度下重组菌株的发酵动力学分析

重组菌株 T44-2发酵初始阶段的菌体生长和乙醇生成较为缓慢，随着时间的推移，增长速度明显加快，经过一段时间，菌体生长和乙醇生成的速度又趋于缓慢，以至停止。根据重组菌株细胞生长和乙醇生成的特性，选用Verhulst Pearl提出的Logistic方程，其表达式为：

利用Origin 7.5对重组菌株T44-2菌体生长曲线和乙醇生成曲线进行拟合。在30 ℃、37 ℃、40 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃的条件下，重组菌株T44-2的菌体生长和乙醇生成趋势均与方程很好地拟合。

根据重组菌株T44-2的残余葡萄糖的变化趋势，选用Gauss方程，其表达式是

图4 CE6和T44-2分别在30 ℃ (A)、37 ℃ (B)、40 ℃ (C)、42 ℃ (D)、43 ℃ (E) 和44 ℃ (F) 下的发酵性能比较Fig. 4 Comparison of fermentation performance of CE6 and T44-2 at different temperature. (A) 30 °C. (B) 37 °C. (C) 40 °C. (D) 42 °C. (E) 43 °C. (F) 44 °C. CE6: Glucose (■), Ethanol (●), Biomass (▲); T44-2: Glucose (□), Ethanol (○), Biomass (△).

利用Origin 7.5对重组菌株T44-2残余葡萄糖曲线进行拟合，在30 ℃、37 ℃、40 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃的条件下，重组菌株T44-2的残余葡萄糖趋势均与方程很好地拟合。

由于不同温度下的重组菌株T44-2的菌体生长、乙醇生成、残余葡萄糖都能很好地与 Logistic方程和 Gauss方程进行拟合，猜测三者与温度之间可能存在一定的线性关系，因此分别以重组菌株 T44-2的菌体生长、乙醇生成、残余葡萄糖为因变量，以温度和时间为双自变量进行多重线性回归分析，经统计学检验，确定重组菌株 T44-2的菌体生长、乙醇生成、残余葡萄糖分别与温度和时间呈现出显著的线性关系，可以建立动力学表达式 (表 1)。重组菌株 T44-2的菌体生长和乙醇生成随着时间的增加而增大，温度的升高而减小；残余葡萄糖则随着时间的增加而减小，随着温度的升高而增大。

表1 T44-2的发酵性能对发酵时间和发酵温度的多重线性回归分析Table 1 Result of multiple regression of fermentation efficiency of T44-2 for time and temperature

3 讨论

酵母菌作为重要的乙醇发酵微生物，广泛应用于乙醇以及其他发酵工业。酵母菌在发酵过程中常常面临高温胁迫，严重地制约着发酵工业的生产效率。因此筛选温度耐受性强、发酵性能高的酵母菌株对于酵母菌在工业生产中的应用具有重要的意义。酵母菌温度耐受性的分子机制非常复杂，它涉及到细胞内多个生理过程的改变，包括热激蛋白的诱导表达[11]，细胞内部结构的稳定性维持[12]，代谢过程的重构等[13-14]。与这些生理过程相关的基因同时受到转录和翻译后的蛋白质修饰等多个水平的调控，不同基因产物之间彼此相互作用，形成了极其错综复杂的调控网络。目前为止，虽然确认了大量与酵母菌温度耐受性相关的基因，但是对这些基因是如何产生和影响细胞温度耐受性的认识还很有限。随着基因工程技术的兴起和对温度耐受性相关基因的不断认识，人们试图通过调控一个或多个温度耐受性相关基因的表达来定向改造酵母菌的耐热性能，从而获得耐高温酵母菌株，但目前还没有很成功的实例。因为酵母菌温度耐受性分子机制的复杂性决定了单个或者少数几个基因的改变难以达到提高酵母菌温度耐受性的效果。

不同的带有“黑箱”属性的微生物育种技术被应用于酵母菌温度耐受性的改进中，Sridhar等通过UV诱变提高了酿酒酵母的温度耐受性，该菌株在30 ℃和40 ℃发酵250 g/L葡萄糖，可以产生98 g/L和62 g/L乙醇[15]；Edgardo等通过自然筛选和适应进化筛选到能够在42 ℃生长的酵母菌株，该菌株在 40 ℃发酵葡萄糖，乙醇产量可以达到理论值的75%[3]。国内的Jin等同样利用UV诱变提高酿酒酵母的耐热性，获得的耐热菌株在40 ℃发酵120 g/L葡萄糖，可以产生28 g/L乙醇[16]。上述研究虽然均获得了能在40 ℃发酵葡萄糖产乙醇的酵母菌，但在糖醇转化率和乙醇产量方面还难于满足现实的需要。近年来基因组改组技术逐渐被应用于酵母菌耐热性的改造中，取得了比较好的研究效果[17]。本研究基于酿酒酵母遗传转化率高，能够进行大片段基因组 DNA转化[18]，技术方法比较成熟的特点，初步探索了一种新的促进酵母菌基因组 DNA变异的方法，并将其应用于乙醇工业酵母的热耐受性改造中，通过基于基因组DNA突变的遗传重组方法筛选到一株温度耐受性和乙醇发酵性能提高的重组菌株T44-2。重组菌株T44-2在30 ℃~40 ℃有良好的发酵性能，能够耐受乙醇工业生产中的温度波动，而对发酵性能没有明显影响，因此重组菌株在实际应用中可以极大减少加热和冷却成本，实现大宗发酵产品乙醇生产的低能耗和低污染，有望带来明显的经济效益。基于基因组DNA突变的遗传重组育种方法，克服了基因工程同时调控基因数量有限的不足，它可以同时在多个位点上引起突变，同时上调和下调多个基因的表达，从而扩大和提高基因的突变频率和范围，为耐高温酵母菌株筛选提供了更大的空间。在上述研究基础上，将进一步优化基于基因组DNA突变的遗传重组方法，提高遗传转化和同源重组的有效性，并尝试在酵母菌其他生理功能进化中的应用。另外重组菌株为什么产生了对温度的广泛适应性是我们非常关注的问题，目前我们正在利用基因芯片技术进行重组菌株和原始菌株的比较转录组学研究。希望通过揭示重组菌株耐热机制，为酵母菌，甚至其他工业微生物耐热性能的理性设计和改造提供重要的解决策略。

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