徐美娟，张显，饶志明，杨娟，窦文芳，金坚，许正宏

1 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122

2 江南大学医药学院，无锡 214122

L-精氨酸 (L-arginine，简称L-Arg) 是一种含胍基的碱性氨基酸，是人体和动物体内的半必需氨基酸，也是生物体尿素循环的一种重要中间代谢物，在医药和食品工业中用途广泛，具有独特的生理和药理作用；L-精氨酸还是配制营养或特殊治疗用途药物的重要原料[1]，发酵法生产精氨酸的研发是目前国内外研究的热点[1-2]。细菌中从 L-谷氨酸合成精氨酸有3条途径：线性途径、循环途径及新发现的利用氨甲酰基转移酶进行精氨酸生物合成的新途径[3-5]，如图1所示。

钝齿棒杆菌 Corynebacterium crenatum、谷氨酸棒杆菌、嗜热链球菌、假单胞菌等利用经济循环途径合成精氨酸，乙酰鸟氨酸转氨酶(N-Acetylornithine aminotransferase，EC 2.6.1.11) (ACOAT) 在合成 L-精氨酸循环途径中催化第 4个酶促反应，即催化底物 N-乙酰谷氨酸半醛合成 N-乙酰鸟氨酸，需要 5-磷酸吡哆醛作为辅酶。反应方程式如下：

随着原料氨基酸的需求量日益增长，用传统诱变育种手段提高L-精氨酸产量已不能满足日益增长的需要，开始利用DNA重组技术及代谢工程手段来调控L-精氨酸相关代谢途径，以达到提高产量的目的。C. crenatum SYPA 5-5是本实验室筛选并经过多步传统诱变得到的一株钝齿状、无芽孢的革兰氏阳性高产 L-精氨酸突变菌株[6-7]。本课题组对 C. crenatum的谷氨酸合成精氨酸的代谢途径相关酶进行了功能分析及其酶学性质的研究，为进一步对精氨酸合成的发酵过程优化提供理论指导意义，在此基础上进行加强表达，并对系列重组菌进行发酵分析。本研究室克隆了来自于高产精氨酸菌株 C. crenatum SYPA 5-5中的乙酰鸟氨酸转氨酶 (ACOAT) 编码基因argD，首先在大肠杆菌中高效表达，利用镍柱亲和层析对表达有活性的重组ACOAT进行纯化，对酶学性质进行初步研究；并构建了重组钝齿棒杆菌/ pJCtac-CcargD (CCD)，在C. crenatum中加强转氨酶的表达，在重组钝齿棒杆菌CCD进行酶活分析的基础上进一步对其发酵产精氨酸进行分析。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

实验所用菌株及质粒见表1。

1.2 培养条件及培养基

大肠杆菌：LB培养基，培养温度37 ℃，旋转式摇床转速160 r/min，氨苄青霉素浓度为100 μg/mL，卡那霉素浓度为50 μg/mL筛选转化子，IPTG诱导终浓度为0.5~1 mmol /L。

图1 细菌L-精氨酸生物合成途径Fig. 1 The arginine biosynthesis pathway in bacteria.

表1 本实验中所用的菌株及质粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

钝齿棒杆菌：LBG培养基 (LB+0.5%葡萄糖)，培养温度30 ℃，往复式摇床转速160 r/min，发酵96 h，转化子选用卡那霉素浓度为30 μg/mL筛选。

斜面培养基 (g/L)：蛋白胨10，牛肉膏5，NaCl 10。pH 7.0、115 ℃灭菌15 min。

摇瓶种子培养基 (g/L)：葡萄糖30，玉米浆20，(NH4)2SO420，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，尿素1.5。pH 7.0~7.2、121 ℃灭菌20 min，装液量30 mL/ 250 mL。

发酵培养基 (g/L)：葡萄糖150 (分消)，玉米浆40，(NH4)2SO420，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.02，生物素8×10−5，L-组氨酸5×10−4，CaCO330。pH 7.0~7.2、121 ℃灭菌10 min，装液量25 mL/250 mL[9]。

1.3 主要试剂及仪器

质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限公司；工具酶、IPTG购自TaKaRa公司；咪唑和抗生素购自上海Sangon公司；L-精氨酸琥珀酸购自 Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺 (American Promega Corporation)、广范围蛋白质分子量标准购自 Fermentas公司；PCR引物由上海赛百盛基因技术有限公司合成；其他试剂均为国产试剂纯。基因扩增仪 (BioRad公司)，电击仪 (Eppendorf)，BIOTECH-5BG 5 L发酵罐 (上海保兴)。

1.4 方法

1.4.1 argD基因的克隆

由于C. crenatum的遗传背景尚不清楚，其与谷氨酸棒杆菌同源性高，因此根据 NCBI中谷氨酸棒

提取C. crenatum SYPA 5-5染色体为模板，PCR扩增条件为：94 ℃，5 min预变性；94 ℃ 50 s，58 ℃1 min 30 s，72 ℃ 1 min 30 s ，35个循环；72 ℃延伸10 min。所得片段胶回收后与克隆载体pMD18-T载体连接，转化E. coli JM109，挑取阳性转化子。提取质粒酶切鉴定，并将重组质粒命名为T-CcargD，测序。

1.4.2 重组大肠杆菌表达载体的构建及乙酰鸟氨酸转氨酶 (ACOAT) 编码基因的诱导表达

将T-CcargD进行EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切，胶回收argD片段，与经相同酶切线性化的pET-28a(+) 载体连接，转化E. coli BL21 (DE3)，筛选阳性转化子。经酶切验证，挑选阳性转化子接种至含卡那霉素(终浓度为50 μg/mL) 的LB培养基中，37 ℃振荡培养过夜，次日按1%接种量转接，至OD600约0.6~0.8时加入IPTG进行 16 ℃过夜诱导表达[10]。

1.4.3 重组大肠杆菌-钝齿棒杆菌穿梭表达载体的构建

将T-CcargD进行SalⅠ、BamHⅠ双酶切，胶回收argD片段，与相同酶切的线性化载体pJC-tac连接，转化大肠杆菌E. coli JM109，筛选阳性转化子，经质粒验证后备用。

1.4.4 SDS-PAGE

采用5%的浓缩胶及12%分离胶的不连续垂直平板电泳，考马斯亮兰R-250染色。杆菌C. glutamicum ATCC 13032的全基因组核苷酸序列中1 176 bp argD基因序列 (GenBank Accession No. BA000036.3)，设计乙酰鸟氨酸转氨酶编码基因的引物如表2所示。

表2 本实验中所用的引物Table 2 Primers used in this study

1.4.5 乙酰鸟氨酸转氨酶的纯化

诱导表达的菌液于10 000 r/min、4 ℃离心收集菌体，进行超声波破碎细胞，PBS缓冲液 (pH 7.4)悬浮菌体，0.45 μm滤膜过滤后上柱，经 Ni-NTA纯化[10]。

1.4.6 乙酰鸟氨酸转氨酶活力的测定[11-14]

酶反应体系：0.5 mL反应液含100 mmol磷酸钾缓冲液 (pH 9.5) (加入不同浓度的 K2HPO4、KH2PO4或由KOH调节至目标pH值)，10 mmol N-乙酰-L-鸟氨酸，5 mmol α-酮戊二酸钾，0.5 mmol 5-磷酸吡哆醛及适量酶液。37 ℃水浴15 min后加入0.2 mL反应终止液 (10 mol/L HCl)，终止反应后沸水浴45 min，冷却至室温后离心，上清加入1 mL 3.6 mmol的醋酸钠和0.2 mL 10 mmol的邻氨基苯甲醛，室温显色15 min，测定440 nm下的吸光值。产物5-吡咯羧酸440 nm的摩尔吸光系数为1.9×103L/(mol·cm)。本实验利用精氨酸合成途径中的逆向反应，采用N-乙酰-L-鸟氨酸和α-酮戊二酸钾为底物，5-磷酸吡哆醛为辅酶，有明显的黄色反应则为有酶活。其原理是利用邻氨基苯甲醛和酶促反应产物自身环化脱乙酰基的 5-吡咯羧酸产生黄色反应，440 nm下测定光吸收值。

一个ACOAT活力单位 (U) 定义为在上述反应条件下，每分钟转化α-酮戊二酸钾生成1 μmol产物环化后生成5-吡咯羧酸所需的酶量。

1.4.7 蛋白质含量测定

酶液蛋白含量采用Bradford法[16]测定，以BSA为标准蛋白。

1.4.8 乙酰鸟氨酸转氨酶的酶学性质的初步研究

最适pH及pH稳定性：配制pH 4.0~12.0的反应缓冲液，30 ℃下将酶分别与不同pH的反应液混合，测定ACOAT在不同pH体系中酶活，观察pH对酶促反应的影响。再将一定量的酶液加入到以上不同pH的反应缓冲液中，30 ℃保温1 h，测定剩余酶活，观察ACOAT在不同pH条件下的稳定性。

最适温度及热稳定性：采用pH 7.0反应液，分别在4 ℃、15 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、45 ℃，55 ℃、65 ℃、80 ℃温度下测定酶活，研究温度对酶的影响。将酶液置于以上不同温度下保温1~5 h，测定剩余酶活，观察ACOAT在不同温度下的稳定性。

不同金属离子、EDTA及精氨酸和鸟氨酸的添加对酶活的影响：在反应液中分别加入终浓度为1 mmol/L的Ca2+、Mg2+、Co2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Li+、Ni2+、Mn2+、Zn2+、Na+以及EDTA、L-鸟氨酸、L-精氨酸，30 ℃下测定ACOAT酶活，以不另加任何物质的反应液作为对照，研究不同金属离子对酶促反应的影响[17]。

1.4.9 重组钝齿棒杆菌的获得

采用电击转化法[18]将重组质粒转化钝齿棒杆菌，涂布含有30 μg/mL卡那霉素的固体LBG平板于30 ℃培养36 h，挑取转化子验证后于斜面保藏。

1.4.10 钝齿棒杆菌的发酵

从斜面挑取一环菌体接种种子培养基，30 ℃于往复摇床培养15~16 h。5 L发酵罐发酵：5 L发酵罐中装液量3 L，接种量5%，通风量3 L/min，流加氨水控制pH 7.0，搅拌转速为600 r/min，30 ℃发酵96 h。

1.4.11 菌体生长的测定

发酵液用0.25 mol/L的盐酸稀释至适当倍数，测定 562 nm处的光密度，按照 1 OD=0.375 g/L DCW，换算为菌体干重 (文中以DCW表示)[7,17]。

1.4.12 发酵液中还原糖的测定

采用SBA-40B生物传感分析仪测定发酵液中葡萄糖浓度[19]。

1.4.13 氨基酸含量的测定

采用坂口试剂法测定精氨酸[20-21]及氨基酸自动分析仪测定发酵液中氨基酸含量。

2 结果

2.1 钝齿棒杆菌argD基因的克隆及分析

以C. crenatum SYPA5-5基因组DNA为模板，引物P1、P2进行PCR扩增，得到大小1 176 bp、编码390个氨基酸的基因片段，连接至pMD18-T载体测序，比对结果表明C. crenatum SYPA argD基因与C. glutamicum ATCC 13032 argD同源性为99.32%，相差8个碱基，4个氨基酸。C. crenatum SYPA 5-5基因 argD核苷酸序列已提交 GenBank数据库(Accession No. HQ602711)。

2.2 重组大肠杆菌BL21 (pET-28a-argD) 的构建

将 T-CcargD用 EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切，回收argD片段后，与线性化pET-28a(+) 连接后转化，阳性转化子提取质粒经 EcoRⅠ、XhoⅠ酶切验证，释放5 369 bp和约1 176 bp大小的片段，分别对应pET-28a(+) 和argD的大小，结果表明质粒pET-28a-CcargD构建成功。

2.3 CcargD基因在E. coli BL21 (DE3) 中表达与重组蛋白ACOAT的纯化

重组菌pET-28a(+)-CcargD/BL21 (DE3)，经诱导表达菌液经超声破碎取上清SDS-PAGE分析，检测到分子量约为42 kDa的特异性条带，如图2所示。上清液测得酶活为65.7 U/g，约为对照菌株BL21粗酶液酶活的6倍，说明argD基因在大肠杆菌中表达，乙酰鸟氨酸转氨酶具生物学活性。采用 Ni-NTA亲和层析，纯化后ACOAT酶液比酶活为108.2 U/g，回收率达77.8%，结果见表3。

2.4 乙酰鸟氨酸转氨酶的酶学性质

2.4.1 最适pH及pH稳定性

由图3可知重组酶的最适反应pH为8.0，但在pH 6.0~9.0范围内酶活均处于较高的水平，在酸性和强碱的条件下，酶活损失严重。将 ACOAT在pH 6.0~10.0处理1~5 h后测定酶活性，在pH 7.0、8.0、9.0、10.0时保温1 h后的酶活力均能保持85%以上的酶活力，说明 ACOAT在弱碱性环境下相对稳定，而重组酶保存在pH值为8.0的缓冲液条件下稳定性最佳 (图4)。

图2 重组菌全细胞蛋白及ACOAT纯化后SDS-PAGE电泳分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of proteins in whole cells and ACOAT purification. 1: supernatant of E. coli BL21 with plasmid pET-28a(+); 2,3: supernatant of E. coli BL21 with recombinant plasmid pET-28a(+)-CcargD; 4: protein markers (kDa); 5: purified ACOAT.

2.4.2 最适反应温度及热稳定性

如图5所示，在4 ℃~80 ℃范围内进行酶促反应，最适反应温度为30 ℃，而已报道的肠杆菌属的乙酰鸟氨酸转氨酶的最适反应温度为 37 ℃[9]。在20 ℃、25 ℃、37 ℃酶活力相似约为在30 ℃条件下的97%；由图6可知，37 ℃保温5 h后有74%活力，55 ℃保温5 h后仍留有69%活力，表明该酶热稳定性较好。ACOAT在4 ℃~40 ℃较稳定，保温1 h后相对酶活仍在80%以上，随着温度的升高，酶稳定性逐渐下降，到达65 ℃时ACOAT几乎完全失活，且检测不到酶活，说明酶已完全失活。

表3 重组酶乙酰鸟氨酸转氨酶纯化表Table 3 Purification of recombinant ACOAT

图3 pH对转氨酶活力的影响Fig. 3 Effect of pH on enzymatic transamination.

图4 乙酰鸟氨酸转氨酶的pH稳定性Fig. 4 pH stability of N-Acetylornithine aminotransferase.

图5 温度对转氨酶活力的影响Fig. 5 Effect of temperature on enzymatic transamination.

图6 乙酰鸟氨酸转氨酶的热稳定性Fig. 6 Thermal stability of N-Acetylornithine aminotransferase.

2.4.3 金属离子及EDTA对ACOAT酶促反应的影响

金属离子可作为酶促反应的辅助因子，在酶促反应中常添加一些金属离子。在 ACOAT酶促反应添加金属离子以及 EDTA，以不加离子的反应液作为对照设其酶活为100%，离子对ACOAT酶活的影响结果见表 4。Ni2+对转氨酶的酶活力有明显促进作用；Mn2+、Cu2+、Fe3+等加入后出现白色絮状沉淀，酶活较低，此时酶蛋白大多已失活；Na+、Li+、NH4+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+及EDTA对酶促反应影响较小；Zn2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+、Co2+均具有一定抑制作用。

2.4.4 精氨酸、鸟氨酸对ACOAT酶促反应的影响

反应体系中添加终浓度为1 mmol/L的L-精氨酸以及L-鸟氨酸 (该酶在以L-精氨酸和L-鸟氨酸为底物时没有转氨活性)，测定代谢途径相关氨基酸对ACOAT酶活影响，分别测得酶活为 104.9 U/g和118.9 U/g，说明 L-鸟氨酸的添加对钝齿棒杆菌ACOAT催化底物N-乙酰鸟氨酸与α-酮戊二酸生成N-乙酰谷氨酸半醛的转氨反应起促进作用，酶活提高 9.89%；L-精氨酸的添加对其酶促反应几乎没有影响，说明此酶不受终产物反馈抑制。

2.5 重组钝齿棒杆菌C. crenatum (pJCtac-CcargD)的构建

构建重组质粒pJCtac-CcargD同上文，经SalⅠ、BamHⅠ双酶切，释放约6 400 bp和1 100 bp大小的片段，分别对应于pJCtac和argD的大小，证明重组质粒构建成功。电击转化C. crenatum SYPA，在含卡那霉素的 LBG平板上筛选阳性转化子 C. crenatum (pJCtac-CcargD)。

2.6 重组钝齿棒杆菌的获得及其与 C. crenatum SYPA中ACOAT酶活力比较

研究发现 IPTG的添加对菌体生长具有一定的毒性，由于tac启动子在钝齿棒杆菌中未经IPTG诱导即有本底表达，因此以下重组菌的发酵中选择不添加IPTG。挑选一组C. crenatum (pJCtac-CcargD)转化子和出发菌株C. crenatum SYPA接种于LBG培养基培养24 h后转接于种子培养基18 h后收集菌体，经超声波破碎，测定粗酶液中 ACOAT酶活，选择其中3组数据如表5所示。可以看出，重组菌粗酶液的转氨酶活力显著提高，其中以 3号转化子提高最多，提高了 84.4%，证明了重组菌 ACOAT表达量加强。

2.7 重组菌 C. crenatum (pJCtac-CcargD) 与 C. crenatum SYPA 5-5发酵产精氨酸比较

挑取酶活提高较多的 8个重组菌 C. crenatum (pJCtac-CcargD) 和出发菌株C. crenatum SYPA同时摇瓶发酵，将8个转化子分别命名为CCD (1~8)，每个转化子取 3个平行，摇瓶发酵产酸比较。将产量最高的转化子命名为 CCD1和出发菌株 C. crenatum SYPA 5-5进行5 L发酵罐发酵，每隔8 h取样对OD、残糖及产酸进行跟踪测定，多次发酵结果表明转化子CCD1产酸稳定，取3次发酵数据绘制图 7，由图可知 CCD1较出发菌株 C. crenatum SYPA 5-5在生长前期稍慢，对数生长期后两者生长状态已基本趋于一致；40 h到96 h为菌体生长的稳定期也是精氨酸积累的关键时期，此时重组菌CCD1发酵产酸优势趋于明显，精氨酸生成率明显提高，至发酵结束时产量达到最高达39.7 g/L，较出发菌株C. crenatum SYPA产酸34.6 g/L提高了14.7%。由耗糖曲线可以看出重组菌的耗糖能力从16 h开始便强于对照出发菌株，到发酵96 h时葡萄糖残留量都为 0。结果表明加强精氨酸合成代谢途径中的转氨酶表达可以增强精氨酸合成的代谢流从而对增强L-精氨酸的合成途径有一定的加强作用，但提高幅度不大。由图7 (E) 可知发酵溶氧曲线，argD的增强表达对菌株的溶氧水平的影响较显著，重组菌CCD1与对照菌株 SYPA相比从发酵起始溶氧曲线始终保持较低水平，说明重组菌发酵罐内氧气利用较多，说明菌体中argD的加强表达提高菌体氧利用率显著。

表4 金属离子及EDTA对ACOAT酶活性的影响Table 4 Effect of metal ion and EDTA on the activity of ACOAT

表5 重组菌与原始C. crenatum SYPA ACOAT酶活力分析比较Table 5 Comparison of ACOAT enzyme activities in the CCD (pJCtac-CcargD/C. crenatum) and C. crenatum SYPA

图7 重组菌CCD1 (pJCtac-CcargD/C. crenatum) 与原始菌株的发酵曲线Fig. 7 Comparison of L-arginine production between the CCD1 (pJCtac-CcargD/C.crenatum) and C. crenatum SYPA. (A) Cell concentration. (B) Glucose concentration. (C) L-arginine concentration. (D) L-arginine production rate. (E) The dissolved oxygen (DO) changing patterns.

3 讨论

本文首先研究了精氨酸合成代谢途径中N-乙酰鸟氨酸转氨酶的酶学性质，C. crenatum ACOAT在弱碱性酶活相对稳定，而来自于E. coli和Klebsiella aerogenes的ACOAT的酶学性质最适温度为37 ℃，最适 pH为 6.5和 7.0[13,22-23]，本课题组还分析了此代谢途径中其他酶的性质，发现argC-argH编码的7个酶最适pH都在6.5~8.0之间，从酶促反应的角度解释了精氨酸发酵过程需要维持pH 7.0~7.5。还发现了Ni2+的促进作用和 Zn2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+、Co2+的抑制作用，这为深入研究其蛋白结构和作用机理，以便更清晰了解C. crenatum SYPA精氨酸合成途径奠定了基础，同时为改良发酵工艺和培养基的优化进一步提高产酸提供了可靠理论依据；本研究还发现了鸟氨酸的添加对 ACOAT的酶活具有一定的激活作用，但其作用机理将在对ACOAT进行蛋白结构分析的基础上进行分析，相关研究正在进行。

另外，利用代谢工程提高L-精氨酸产量最重要的策略之一是提高关键酶酶量，郝宁等在加强了钝齿棒杆菌中合成精氨酸关键酶基因N-乙酰谷氨酸激酶表达后其产量提高了25%[24]。本课题组同样也对C. crenatum SYPA 5-5的精氨酸合成关键酶基因argB进行了加强表达研究，重组菌CCB产酸量提高较明显，提高幅度为 23.4%，与郝宁等的研究结果相似。本文通过增加转氨酶编码基因表达量，较出发菌株ACOAT酶活提高了84%；发现ACOAT的增强表达对菌株溶氧水平影响显著，课题组前期研究发现溶氧在精氨酸的合成中起重要作用，高溶氧条件下精氨酸的产量明显高于低溶氧条件下的产酸量[7]，重组菌 CCD1在发酵精氨酸过程中氧利用率明显高于对照菌株，从实验结果来看，重组菌精氨酸产量提高一方面是由于 argD的过量表达增强了精氨酸合成代谢流，另一方面是由于菌体自身氧利用率提高，从而使得重组菌精氨酸的产量提高了14.7%。本研究为构建高产精氨酸重组基因工程菌提供理论依据，具有一定的指导意义。另外本文证明了加强合成代谢途径中某一种酶 (关键酶/非关键酶) 的表达既可以增强产物合成代谢流量，也可能改变菌体的某些其他发酵性能，这为氨基酸代谢研究提供了一定的实践参考。

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