倪辉，洪清林，肖安风,2，李利君，蔡慧农，苏文金

1 集美大学生物工程学院，厦门 361021

2 福建省高校食品微生物与酶工程技术研究中心，厦门 361021

3 厦门市食品与生物工程技术研究中心，厦门 361021

虾青素 (Astaxanthin) 是一种含氧类胡萝卜素，具有超强的抗氧化活性，同时还具有抑制肿瘤发生、增强免疫、抗炎症、机体着色等多种生物学功能，在功能性食品、饲料、化妆品、医药等方面有着广泛的应用[1-3]。

利用法夫酵母Phaffia rhodozyma发酵生产虾青素具有发酵条件容易满足、发酵培养基简单、易实现工厂化生产、不受气候条件影响等优点，是最具产业化前景的天然虾青素生产方法[5-6]。上世纪 80年代以后，人们从虾青素的合成机理[7]、优良菌株选育[8-10]、发酵工艺条件优化[11-16]、提取工艺优化[17-18]、廉价培养基的选择[19-20]及虾青素合成酶基因的克隆与表达[21]等多方面对法夫酵母发酵虾青素进行了全面研究，虽然已经基本阐明了法夫酵母的生物学特性、虾青素的合成代谢机理、发酵培养基的基本成分和发酵条件，但到目前为止，所报道的法夫酵母的虾青素细胞产率最高为3~3.5 mg/g[9-10,22]，虾青素发酵产量最高为 60 mg/L[22]，虾青素的发酵水平一直停滞不前，虾青素的产业化发酵一直没有成功，很多科研单位及企业都放弃了对虾青素发酵生产技术继续进行研究，近年来相关研究陷入了低谷。

虽然目前很容易购买到先进的发酵设备及建立工业发酵技术，但没有选育获得符合产业化生产要求的高产菌株制约了虾青素发酵技术的产业化应用。因此，选育优良的生产菌种是提高虾青素发酵水平、推动虾青素发酵产业化的最根本途径。本实验室在前期研究基础上[14,22]，选育得到了一株高产虾青素的法夫酵母 (Phaffia rhodozyma JMU-MVP14)，其虾青素细胞产率可达到 5 g/L以上，从出发菌株(Phaffia rhodozyma JMU-668) 所能达到的生物量(60 g/L) 来看，对该菌株进行高密度发酵，其虾青素产量应该能达到300 mg/L以上。按目前虾青素的市场价值 ($2 000/kg) 估算，如果虾青素的发酵产量能达到 200 mg/L，则其生产成本和产品价值相当，如果发酵产量高于250 mg/L，则具有产业化发酵价值；以此为根据，该菌株应该是一株具有产业化前景的高产菌株。因此，进一步评估该菌株的生产性能，明确该菌株是否具有产业化价值对于虾青素的发酵生产具有重要的意义。

前期试验表明，Phaffia rhodozyma JMU-MVP14的生长及产虾青素的条件与其他法夫酵母菌株相似，但发酵pH值的调控方式及补料液成分对虾青素的合成却具有较大的影响。针对这些情况，本文在对发酵 pH值的调控方式及补料液成分进行比较研究的基础上，侧重于考察该菌株高密度发酵虾青素的生产性能，为后续研究及产业化应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株

法 夫 酵 母 出 发 菌 株 (Phaffia rhodozyma JMU-668)：由法夫酵母 Pst-1菌株 (德国柏林工业大学stahl教授赠送) 经紫外诱变，用薄层色谱法筛选得到，其特点是虾青素占总类胡萝卜素的95%以上。

法夫酵母虾青素高产菌株 (Phaffia rhodozyma JMU-MVP14)：由出发菌株经甲基磺酸乙酯诱变，用 0.5%的双氧水结合紫外照射产生自由基淘汰低产菌株选育得到，本实验室保存。

1.1.2 培养基

斜面培养基与种子培养基：4º Bx麦汁培养基，pH 6.0；制备斜面培养基时添加1.5%的琼脂。

摇瓶发酵培养基：葡萄糖 20 g/L，硫酸铵5 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，硫酸镁0.5 g/L，氯化钙0.2 g/L，酵母膏3 g/L，pH 6.0。

分批发酵培养基：葡萄糖 30 g/L，硫酸铵5 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，硫酸镁0.5 g/L，氯化钙0.2 g/L，酵母膏2 g/L，pH 6.0。

补料分批发酵培养基：葡萄糖30 g/L，硫酸铵5 g/L，磷酸二氢钾3 g/L，硫酸镁3 g/L，酵母膏15 g/L，pH 6.0。

1.1.3 试剂及药品

虾青素标准样品购自Sigma试剂公司；葡萄糖(分析纯)、磷酸二氢钾 (分析纯)、氯化钙 (分析纯)、硫酸氨 (分析纯)、无水硫酸镁 (分析纯)、3,5-二硝基水杨酸 (分析纯)、氢氧化钠 (分析纯)、亚硫酸钠(分析纯)、无水乙醇 (分析纯)、二甲亚砜 (化学纯)、酵母膏等都为上海国药集团有限公司产品。

1.1.4 主要仪器

FA2004型电子天平 (上海精密科学仪器有限公司)，LXJ-IIB型低速大容量多管离心机 (上海安亭分析仪器厂)，ZHWY-2102型双层全温度恒温摇床(上海智城分析仪器制造有限公司)，SP-DJ系列垂直净化工作台 (上海浦东伟普净化设备厂)，101-3B型电热鼓风干燥箱 (上海市实验仪器总厂)，UV-2600A型紫外可见分光光度计 (尤尼柯 (上海) 仪器有限公司)，NBS Bioflo-110 7 L发酵罐 (New Brunswick Scientific Company)，GUJT100L-1000L型中试型发酵罐 (镇江东方生物工程设备技术有限责任公司)，Waters 1525 型液相色谱仪 (Waters Corporation，Milford，MA，USA)。

1.2 方法

1.2.1 摇瓶种子的制备

将斜面活化的菌种接种于装有30 mL种子培养基的250 mL摇瓶中，于22 ℃、190 r/min 培养96 h得到1代摇瓶种子。取1 mL 1代摇瓶种子转接到新鲜的种子培养基中，在相同的条件下培养48 h得到摇瓶种子。

1.2.2 摇瓶发酵试验

将1 mL摇瓶种子接入装有30 mL摇瓶培养基的250 mL摇瓶中，在22 ℃、190 r/min的条件下培养120 h后测定发酵液中的生物量、总类胡萝卜素及虾青素。

1.2.3 7 L罐分批发酵试验

以5%的接种量将摇瓶种子接种至装有5 L发酵培养基的7 L发酵罐中，控制发酵温度22 ℃，发酵pH 6.0，通气量为3 L/min，通过调节搅拌转速将溶氧控制在 30%~50%之间进行发酵，转速下限为200 r/min，上限为800 r/min，定时取样分析，对比以下两种pH调控方式对发酵的影响。

1) 自动流加控制pH值：整个发酵过程中通过用10%氨水自动流加调控pH值。

2) 手动间歇调整 pH值：发酵初始时 pH随发酵时间的延长而下降，发酵至60 h，pH降低至2.5，打开碱泵补氨水使pH值升高至6.14后关闭碱泵，发酵至72 h，pH降低至3.77，补氨水使pH值升高至5.98后关闭碱泵后继续发酵直至108 h。

1.2.4 7 L罐补料分批发酵试验

整个发酵过程中溶氧控制在 30%~50%之间，每隔12 h取样测定发酵液中的糖度，当糖度低于1%时进行补料使发酵液的葡萄糖浓度达到4%，控制发酵过程中糖浓度为 1%~4%，通过检测样品的生物量、虾青素及总类胡萝卜素含量，对比两种补料液对补料分批发酵虾青素的影响。补料液 1为50%的葡萄糖；补料液2为50%的葡萄糖、0.5%的酵母膏及0.3%的玉米浆。

1.2.5 1 m3罐发酵试验

以2%的接种量将摇瓶种子接种至装有75 L发酵培养基的100 L种子罐中，在温度22 ℃、pH 6.0、溶氧 30%~50%的条件下培养 72 h，转接入装有750 L发酵培养基的1 m3发酵罐中进行发酵。发酵过程中控制发酵温度22 ℃，利用10%氨水自动流加控制pH为6.0，调节搅拌转速和通气量控制溶氧值在30%~50%之间，每隔12 h取样测定发酵液中的糖浓度，当初糖耗完后，流加60%的葡萄糖液维持发酵液糖浓度不大于1 g/L。

1.3 检测方法

用干重法测定生物量[22]，液相色谱法测定虾青素含量[22]，紫外分光光度法测定总类胡萝卜素[22]，3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖[23]；总蛋白、总脂肪、总糖及灰分测定采用AOAC推荐的方法[24]。

1.4 相关参数及其缩写

相关参数的计算公式及其缩写见表1。

1.5 发酵动力学的计算

用 Monod模型描述发酵生长动力学，用Luedeking-Piret模型描述产物生成动力学。

1.6 数据处理与分析

摇瓶试验为5次平行试验的平均值，用DPS软件进行显著性分析；罐上发酵为3次平行测定的平均值，一次参数用Excel软件计算标准差，并在作图时添加误差线，二次参数由一次参数的平均值计算。

表1 发酵参数的计算及公式Table 1 Fermentation parameters and their calculations

2 结果与分析

2.1 摇瓶培养

如表 2所示，高产菌株 (P. rhodozyma JMUMVP14) 的生物量显著低于出发菌株 (P. rhodozyma JMU-668)，而总类胡萝卜素的体积产率、虾青素体积产率、总类胡萝卜素细胞产率、虾青素细胞产率分别是28.45 mg/L、16.53 mg/L、10.38 mg/L及6.01 mg/g，都显著高于出发菌株。

2.2 7 L罐分批发酵

如图 1所示，用自动流加的方式控制发酵液的pH，法夫酵母JMU-MVP14的糖消耗、生物量、对数生长期的生长速率、生长比速率等都大于手动间歇调节pH的发酵模式。由图2可知，用自动流加的方式控制发酵液的pH，表征法夫酵母JMU-MVP14虾青素合成的主要参数，即虾青素的体积产率、细胞产率、合成速率、合成比速率等都大于手动间歇调节pH的发酵模式。对自动流加控制pH值的发酵结果进行动力学分析，其生长及产物合成动力学如图3所示，μmax和Ks分别为0.20 h−1及21.73 g/L (图3A)；产物合成的模型可表示为 qp=0.74μ+0.15 (图3B)，说明该法夫酵母合成虾青素的模型为部分生长关联型，即部分虾青素是在生长时合成的，而更多的虾青素是在细胞生长后合成的。

表2 高产菌株与出发菌株摇瓶发酵试验结果Table 2 Comparison of astaxanthin high producing strain and original strain by flask experiments

图1 pH值控制方式对法夫酵母JMU-MVP14生长及糖消耗的影响Fig. 1 Effects of the pH value controlling style on the growth and sugar utilization of P. rhodozyma JMU-MVP14. (A) Comparison of the sugar utilization. (B) Comparison of the biomass. (C) Comparison of the growth speed. (D) Comparison of the specific growth rate. The fermented sample by auto-controlling pH value at 6.0 (■). The fermented sample by discontinuously adjusting pH value at 6.0 (□).

2.3 7 L罐补料分批发酵

图2 pH值控制方式对法夫酵母JMU-MVP14虾青素合成的影响Fig. 2 Effects of the pH value controlling style on the astaxanthin syntheses of P. rhodozyma JMU-MVP14. (A) The volumetric productivity of astaxanthin. (B) The specific productivity of astaxanthin. (C) The synthesis speed of astaxanthin. (D) The specific productive rate of astaxanthin. The fermented samples by auto-controlling pH value at 6.0 (■); the fermented samples by discontinuously adjusting pH value at 6.0 (□).

图3 法夫酵母JMU-MVP14生长及产物合成动力学分析Fig. 3 Kinetic analysis of the growth and astaxanthin production of P. rhodozyma JMU-MVP14. (A) The kinetic model of growth. (B) The kinetic model of astaxanthin synthesis.

图4 补料培养基对法夫酵母JMU-MVP14生长的影响Fig. 4 Effects of the feeding medium on the growth of comparison of the growth of P. rhodozyma JMU-MVP14. The feeding medium containing glucose only (■). The feeding medium containing glucose as well as yeast extract and corn syrup (□).

如图 4所示，在发酵过程中补充酵母膏及玉米浆不但不能提高生物量，相反其生物量还低于只补充葡萄糖时的情况。如图 5所示，在发酵过程中只补充葡萄糖液，总类胡萝卜素的体积产率、总类胡萝卜素的细胞产率、虾青素的体积产率、虾青素的细胞产率都大于同时补充葡萄糖和有机氮源时的对应值。这说明法夫酵母JMU-MVP14对氮源及生长因子的要求不高，增加酵母膏及玉米浆的含量并不能提高虾青素的产量，相反会降低虾青素的产量。在7 L罐中进行补料分批发酵，最大生物量、虾青素体积产率、虾青素细胞产率、总类胡萝卜素体积产率、总类胡萝卜素细胞产率分别达到了32.81 g/L、155.99 mg/L、4.94 mg/g、399.99 mg/L、12.19 mg/g (图4~5)。

2.4 1 m3罐分批补料分批发酵

如图6所示，在1 m3罐中补料分批发酵虾青素，当初糖耗完后，葡萄糖浓度一直都维持在相对比较低的水平；生物量在发酵前期快速增加，至发酵后期增加速度变慢；总类胡萝卜素在整个发酵过程中都快速增加；虾青素在发酵前期快速增加，后期增加速度变慢，虾青素占总色素的百分比一直维持在47%左右 (数据未列出)；至发酵终点时，生物量为85.11 g/L、虾青素体积产率、总类胡萝卜素体积产率都达到最大，分别为 279.96 mg/L及618.01 mg/L；此时，虾青素和总类胡萝卜素的细胞产率分别为3.29 mg/g 和7.26 mg/g，菌体中蛋白质含量为21.54%，总糖为41.34%，脂肪为34.31%，灰分为1.58% (图7)。

3 讨论

选育优良菌株及提高虾青素的发酵产量是虾青素发酵生产研究的主要课题，法夫酵母JMU-MVP14菌株的虾青素含量远高于目前所报道最好的虾青素生产菌株[9-10,22,25]；其总类胡萝卜素含量接近了An等根据荧光量及法夫酵母体积预测的类胡萝卜素含量的极限值 (15 mg/g)[26]。该法夫酵母的 μmax与相关研究结果相近[27-29]，Ks与Meyer等的研究结果相近[25]，但高于 Reynders及本实验室的前期研究结果[22,29]。μmax及Ks表明法夫酵母JMU-MVP14在高糖浓度下可以快速生长，明显区别于其他法夫酵母菌株所显示的 Crabtree效应[29]。法夫酵母JMU-MVP14合成虾青素的模型为部分生长关联型(图3B)，与其他报道的虾青素合成模型相似[30]，但其虾青素合成的两个参数0.74 (表示每生长1 g菌体就合成0.74 mg虾青素) 及0.15 (表示每g菌体每小时合成 0.15 mg的虾青素) 都远大于其他报道的菌株[22,30]。

图5 补料培养基对补料分批发酵过程中总类胡萝卜及虾青素的影响Fig. 5 Effect of the feed medium on the production of total carotenoids and astaxanthin by batch-fed culture. (A) The volumetric productivity of total carotenoids. (B) The specific productivity of total carotenoids. (C) The volumetric productivity of astaxanthin. (D) The specific productivity of astaxanthin. The feeding medium containing glucose only (■); The feeding medium containing glucose as well as yeast extract and corn syrup (□).

图6 1 m3罐补料分批培养法夫酵母JMU-MVP14的结果Fig. 6 Results of the batch-fed cultivation of P. rhodozyma JMU-MVP14 in 1 m3 fermentor. Volumetric productivity of astaxanthin (■). Volumetric productivity of total carotenoids (△). Biomass (●). Residual sugar (×).

图7 法夫酵母JMU-MVP14菌体的主要成分Fig. 7 Main composition of P. rhodozyma JMU-MVP14.

虾青素是胞内脂溶性产物，受细胞容积及脂肪含量的限制及影响，每个法夫酵母细胞只能合成极有限的虾青素，虾青素素的产量是其细胞产率与法夫酵母生物量的乘积，要实现虾青素的高产发酵，不仅要有高产菌株，还要求建立高密度培养技术，在保持虾青素细胞产率较高的前提下，尽可能提高其生物量。前期研究表明，当培养基中葡萄糖的浓度超过40 g/L时，法夫酵母JMU-MVP14菌株的生长速度及细胞得率系数就会显著降低，因此，用含有高浓度葡萄糖的培养基进行分批发酵不能获得虾青素的高产，而采用补料分批发酵的模式，用葡萄糖浓度较低的初始培养基培养法夫酵母，当初糖消耗以后，补充一定浓度的葡萄糖，控制发酵液中葡萄糖的浓度不超过40 g/L，当该部分葡萄糖消耗以后，继续补充葡萄糖，如此不断循环，随着葡萄糖不断补充到发酵液中，生物量及虾青素产量将按一定的比例不断增加，用这种模式进行发酵，最终可获得很高的生物量及虾青素产量。根据补料分批发酵的理论及前期研究基础，从以下 3个方面开展研究：1) 确定发酵过程中pH值的控制模式；2) 确定补料分批发酵过程中的补料培养基成分；3) 用1 m3罐中试测定法夫酵母JMU-MVP14及其补料分批发酵虾青素的生产性能，建立了法夫酵母JMU-MVP14菌株罐上高产发酵虾青素的工艺。结果表明采用氨水自动流加的方式调控pH值，用葡萄糖浆为补料培养基相对间歇手动调控pH及用葡萄糖、酵母膏、玉米浆组成的补料培养基更有利于虾青素的合成。与摇瓶及7 L罐分批发酵相比，在7 L罐及1 m3罐中进行补料分批发酵，由于发酵结束时总耗糖量大量增加，法夫酵母JMU-MVP14的生物量大幅度提高，生物量的提高导致了虾青素的产量 (体积产率) 大幅度提高，如，摇瓶发酵、7 L罐分批发酵、7 L罐补料分批发酵及 1 m3罐补料分批发酵的生物量分别是 2.75、11.20、32.80、85.11 g/L，与生物量相对应的虾青素含量分别为28.45、72.47、155.99、279.96 mg/L。

发酵中试是建立产业化发酵工艺的必要环节，在1 m3发酵罐中进行的发酵试验所达到的产量水平具有重要的产业化发酵参考价值。本研究中，1 m3罐的虾青素产量及生物量都高于7 L罐中补料分批发酵的相应值，说明在小罐中建立的虾青素补料分批发酵工艺容易在中试型发酵罐中得到实现，只要保持相同的搅拌流型，采用氨水自动流加控制pH，溶氧与转速相偶联控制在 30%~50%，就可实现在中试罐中高产发酵虾青素。1 m3罐及7 L罐中虾青素细胞产率分别为4.94 mg/g及3.29 mg/g，说明1 m3罐的虾青素产量比7 L罐更高的原因并不是虾青素细胞产率提高引起的，而是由于生物量的提高所造成的。现代发酵理论表明，中试型发酵罐与5 L或7 L罐相比，其传质条件的改善往往会引起生物量及目标产物浓度的增高，这是引起1 m3罐中法夫酵母JMU-MVP14生物量比7 L罐大幅度提高的原因，根据这个规律，预计在生产型的发酵罐中进行产业化发酵，该法夫酵母的生物量及虾青素产量还将进一步提高。

本研究结果说明，用法夫酵母JMU-MVP14进行补料分批发酵，可以实现虾青素高产发酵，其产量水平达到了产业化发酵生产的要求；同时，法夫酵母JMU-MVP14菌株还含有大量的其他类胡萝卜素，其发酵产量可达300 mg/L以上，可通过进一步研究，将其转化为虾青素或开发其利用价值；此外，该法夫酵母还含有丰富的蛋白质、糖类及脂肪，可从提取虾青素后的菌体中回收这些成分并加以利用；因此该菌株具有良好的产业化应用前景。

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