用同工酶电泳快速鉴定甜瓜品种的真实性与纯度研究

2010-11-29郑伟华王富兰

种子科技 2010年9期

郑伟华，王富兰，陈贺

（新疆农科院中心实验室，新疆乌鲁木齐 830000）

品种纯度是种子最重要的质量指标。传统的品种室内纯度检验方法有很大的局限性。种植鉴定需要时间长、花费大，无法用于常规纯度检验。因此，品种纯度检验方法的研究一直是国内外近代种子科学的热点与难点。三十多年来，电泳谱带法的应用研究表明，它是一种快速、准确、经济适用的作物品种纯度检测技术。

同工酶的特点是：具有明显的种属、组织和发育阶段的特异性，既可作为生理指标，又是可靠的遗传标志。植物种子的同工酶谱型是长期的自然或人工杂交选育的结果，是基因表达的产物，记录了物种在发育过程中的血缘关系，说明了种间与品种间深刻的遗传差异，这种差异不易受环境条件的影响而改变。因此，同工酶是鉴别品种间遗传差异的重要标志，这在品种真实性和纯度检验上有着非常重要的意义。

为系统研究甜瓜种子蛋白多态性与品种纯度和真实性鉴定的关系，我们选用了4种具有一定代表性的同工酶进行电泳鉴定。其中，过氧化物同工酶和乙醇脱氢酶同工酶属于氧化还原酶类，这类酶可以催化有机体的各种氧化还原反应；酯酶同工酶和酸性磷酸酯酶同工酶属于水解酶类，可以催化复杂有机物加水分解为较简单的化合物。

1 材料与方法

1.1 材料

选用生产推广种植的杂交伽师瓜1号、雪里红、新组合9808的杂交种及其父母本共9个材料作为研究对象。所用材料均由新疆农业科学院园艺所提供，所有种子批均进行了系谱鉴定，种子的来源和纯度经过确认。

1.2 方法

1.2.1 样品提取：取杂交伽师瓜1号、雪里红、组合9808的杂交种及其父母本和新红心脆的杂交种种子的欲测种子剥壳后放入小研钵中，冰浴研磨再转入离心管中，每管分别加入80 μL的样品提取液后浸提过夜，9 000 r/min离心15 min，取其上清液进行电泳分析。

（1）提取液 A：蔗糖 20 g、溴酚蓝 0.125 g，定容至50 mL。

（2）提取液B(即电极缓冲液)：甘氨酸 7.2 g、Tris1.5 g，调pH值为8.3后定容至250 mL。

（3）样品提取液：使用时取提取液 A10 mL、提取液 B2 mL、水8 mL混匀备用。

1.2.2 电泳方法：采用垂直板不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，下层分离胶浓度为10%，上层浓缩胶浓度为5%。胶板厚度为1.0 mm，样品篦子为15龄，加样量为每孔15μL。凝胶制备时，取适量凝胶储备液，加入数滴新配置的10%过硫酸铵和适量的TEMED，快速混匀，倒入制胶室，插好样品梳。胶体凝固后将胶模放入电泳槽，并用适当体积的电极缓冲液注入电泳槽，取样品上清液15～20 μL点样。电泳在4℃下进行，电泳电压稳压80～150 V，电泳时间2～4 h。

1.2.3 染色方法：酯酶同工酶染色采用醋酸-α-萘酯坚牢蓝RR盐法，过氧化物同工酶染色采用醋酸联苯胺法，乙醇脱氢酶同工酶染色采用辅酶ⅠNBT PMS染色法。电泳结束后剥下胶板用自来水冲洗两次，倒入50～100 mL染色液。在37℃温箱内保温40 min，每隔几分钟摇动一次，待胶板呈现出清晰的深蓝色谱带为止。染色后的胶片用乙醇凝胶洗涤液（乙醇100 mL、乙酸400 mL、甘油200 mL、水800 mL）洗净。胶片可照相、制成干胶或用BIO RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统扫描将图谱记录在磁盘中，以备分析鉴定。

1.3 仪器

电泳仪为BIO RAD POWER PAC1000型。电泳槽是Mini PROTEAN 3 Cell型。BIO RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统。

2 结果分析与讨论

2.1 电泳图谱的分析

从图1、图2可以看出，杂交伽师瓜1号、雪里红、组合9818的杂交种及其父母本种子和新红心脆的杂交种种子的酯酶同工酶均有Rf值为0.11、0.21、0.30、0.47、0.63、0.71、0.84、0.90、0.96 的 9 条带 (见图 1)，不同品种之间在部分谱带的强弱上有一定的差异。

乙醇脱氢酶同工酶均有Rf值为0.74的1条带(见图2)，其中，杂交伽师瓜1号的杂交种种子还有一条Rf值为0.82的带。

过氧化物同工酶、酸性磷酸酯酶同工酶均无谱带。

2.2 讨论

在同一条件下重复分析结果显示,甜瓜种子中酯酶同工酶的多态性最多，但不同的同工酶图谱间均无特异性谱带。这是因为目前甜瓜育种中使用的亲本材料亲缘关系很近，它们之间即使存在差异也是细微、不易分辨的。本试验结果再次证明，电泳方法的分辨率较低，不能分辨出这种差异。因此，种子同工酶电泳法不适于鉴定甜瓜父母本和杂交种的品种纯度。应在今后的工作中探讨利用其他方法例如高效液相色谱法、分子生物学方法等鉴定甜瓜品种真实性与纯度的可能性。