李思银，杨亮宇，杨玉艾

（云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明 650201）

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一种猪的高度接触性肠道传染病，病猪以严重腹泻、呕吐和脱水为主要临床特征[1]，俗称冬季拉稀病。本病于1977 年由比利时的Pensaert 首先发现，并从病料中分离出一株不同于猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）的病毒，将其命名为类冠状病毒（CVL）CV777 株。随后英国、匈牙利、西德、加拿大、日本等国相继报道有该病的发生。1982年国际病毒分类委员会将该病毒归类为冠状病毒属。我国于1980 年首次分离得到PEDV，以后许多地区均报道有该病的发生。据有关部门对我国26 个省、市、自治区1987-1989 年疫病普查的不完全统计，在36 种猪病总死亡率中该病的死亡率占1.74%。近年来，该病的流行区域有不断扩大的趋势，成为严重危害养猪业的传染病之一。

1 病原学

PEDV 为冠状病毒科冠状病毒属的成员，有囊膜，囊膜上有花瓣状纤突，长12～24 nm，由核心向四周放射，其间距较大且排列规则，呈皇冠状。该病毒平均直径为130 nm（95～190 nm），在外界条件下呈球形，而在粪便中常呈现多种形态。目前发现，该病毒只有一个血清型，不能凝集人、兔、猪、鼠、犬、马、 羊、牛的红细胞。该病毒对外界抵抗力弱，对乙醚、氯仿敏感，一般消毒药可将其杀灭，60 ℃ 30 min，可使其失去感染力，但在4 ℃，pH 5.0～9.0、37 ℃，pH 6.5～7.5 或50 ℃条件下相对稳定。

2 流行病学

该病仅发生于猪，各种年龄的猪均可感染发病，哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率可达100%，母猪的发病率在15%～90%，哺乳仔猪尤为严重，病死率平均为50%，成年母猪发病率10%～90%。病猪和带毒猪是主要传染源，被含有病毒的粪便污染的运输车辆、饲养员的鞋子或其他带毒的动物，均可成为本病的传播媒介，主要通过消化道传播，也有经呼吸道传播的报道。PEDV 可在猪群中持续存在，并能在猪体内产生一定的免疫记忆。各种年龄的猪对该病均易感，本病多发生于冬季，12 月份至翌年2月份为本病的高发期，夏季也可发生。PEDV 可单一感染，也可与TGEV 混合感染，但以混合感染较为常见。近年来，临床上出现了PEDV 与猪圆环病 毒（porcine circovirus，PCV） 混合感染的报道，但发病原因尚不明确。

3 临床症状

PED 常以暴发性腹泻的形式发生在非免疫断奶仔猪或各种年龄的猪，主要临诊症状与TGE 相似，多表现为水样腹泻，粪稀如水，呈灰黄色或灰色，或于进食或吮乳后伴发呕吐，但程度较轻，传播稍慢。病猪具体临床表现因年龄不同而有差异，年龄越小，临诊症状越重。1 周龄内新生仔猪常于腹泻后2～4 d 内因脱水而死亡，病死率可达50%。断奶猪和肥育猪以及母猪常呈现沉郁和厌食等临诊症状，持续腹泻4～7 d，逐渐恢复正常。成年猪仅表现沉郁、厌食、呕吐等临诊症状，如果没有继发其他疾病并护理得当，猪只很少发生死亡。少数病猪出现体温升高1～2 ℃，精神沉郁，食欲减退或废绝，尤其是繁殖种猪。

4 病理剖检

该病的病理剖检变化主要在小肠，表现为小肠膨胀，充满淡黄色液体，肠壁变薄，空肠段上皮细胞的空泡形成和表皮脱落。少数病例小肠黏膜有出血点，肠系膜淋巴结水肿，胃内有多量的黄白色凝乳块，其他实质性器官无明显病理变化。电镜观察可见肠绒毛萎缩，绒毛与肠腺的比率从正常的7 ∶1 降至3 ∶1[2]。

5 诊断

该病的流行病学和临床症状方面与猪传染性胃肠炎无显著差别，只是传播速度比较慢，无法通过临床症状、流行病学和病理变化进行确诊，必须借助于实验室检查方法才能确诊。目前，常用的实验室检查方法有病毒的分离鉴定、微量血清中和试验、免疫电镜（IEM）、免疫荧光（FAT）、ELISA、RT-PCR 等。

5.1 病毒的分离鉴定

由于细胞培养液中的小牛血清会抑制PEDV 与细胞受体的结合，且胰酶有一定的耐受性，另外原代PEDV 不易在猪肾传代细胞系（PK-15、IBRS）及非洲绿猴肾（Vero）等细胞上增殖，故该病毒很难培养。1982 年通过胎猪肠上皮细胞单层和胎猪小肠绒毛上皮细胞成功分离得到1 株病毒。近年来又将其适应了Vero 细胞。也有研究表明：用含有60 μg/mL 胰酶液的细胞培养液中进行PEDV 传代适应，在第3 代就出现明显的CPE，第5 代毒价可达10-7.0/0.1mL，并通过乳猪回归试验和特异性中和试验证实所增殖的病毒为猪流行性腹泻病毒[3]。这些病毒分离鉴定的方法对PED血清学、病原学、免疫学等方面的研究提供了一个良好的技术平台，但由于病毒的分离鉴定需要有一套成熟的细胞培养体系，而且PEDV需要在细胞系中连续传代才能出现明显的CPE，目前尚无法推广应用。

5.2 微量血清中和试验

林志雄等[4]利用已适应于传代细胞生长的猪流行性腹泻病毒PEDV-G1株，以PK-15 作指示细胞，与被检血清进行微量中和，测定待检血清中的特异性抗体，48 h 进行结果判定，证实该方法可以用来检测猪流行性腹泻病毒，而且检测结果准确、可靠，具有较高的敏感性，可用于大规模的流行病学调查，并建立了PED 微量血清中和试验。但该方法需要标准毒株作为指示毒株和成熟的细胞培养体系，实验条件的限制因素比较多，很难在短期内应用于临床实践。

5.3 免疫电镜法（IEM）

IEM 法可用已知的PEDV 高免血清检测未知的病毒，又可用已知的PEDV 抗原检测未知抗体。取经滤过的肠内容物，加等量经过稀释的高免血清，混合后在37 ℃条件下感作30 min，再移至4 ℃感作18 h，然后将标本在4 ℃以31 000 r/min 离心60 min，沉淀物以少量蒸馏水悬浮后铺在铜网上，用2%磷钨酸负染后作电镜观察，如可疑病料中含有猪流行性腹泻病毒粒子，由于抗原和抗体的特异性结合，病毒粒子呈晶格状排列，并可见到毒粒间的抗体桥。王继科等[5]把PEDV 的抗原和抗体分别经10 000 r/min 离心、免疫复合物又经12 000r/min 离心后，通过电镜观察到了典型的病毒粒子形成的免疫复合物，并建立了具有3 次筛选作用改良的IEM 法。该方法简便、直观、快速、定性准确，但该方法要求有价格高昂的电镜设备，而且电镜检查一般需3～7 d 才能出报告，不适用于大规模临床诊断。

5.4 免疫荧光法

试验研究证明，用直接免疫荧光法（fluorescent antibody technique，FAT）检查病料中的猪流行性腹泻抗原是可靠的特异性诊断方法，目前应用最为广泛。取病猪小肠作冰冻切片或小肠黏膜抹片，风干后丙酮固定，加荧光抗体染色，充分水洗，封盖镜检，1～2 h 即可得出结果。为了与猪传染性胃肠炎鉴别，最好同时用猪传染性胃肠炎荧光抗体染色检查。崔现兰等[6]对免疫荧光法用于猪流行性腹泻的诊断进行了大量的探索，结果表明：FAT 的检出率为91.4%，间接免疫荧光法（IFAT）的检出率为89%，而且比电镜更敏感、更可靠。林志雄等[7]用适应于Vero、PK-15 等传代细胞株生长繁殖的PEDV-G1 株建立了PEDV 的直接免疫荧光法，并与哈尔滨兽医研究所的荧光抗体方法检测结果相比较，阳性符合率达95%（19/20），阴性符合率90%（9/10），且与猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、轮状病毒和大肠杆菌等没有交叉反应，证明FAT 法用于猪流行性腹泻的诊断具有较高的准确性和特异性。由于该方法需要在病死猪只或在腹泻早期扑杀后取肠道组织制备切片，故很难用于临床诊断。

5.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)

ELISA 试验可直接应用于粪便中PEDV 的检测，而且比电镜更敏感、可靠，应用较为广泛。当病猪一出现腹泻，即可进行检测，甚至痊愈不久的病猪，仍可用该方法进行检测。陈茹等[8]用分离纯化的PEDV 抗原，建立了用于检测PEDV 抗体的斑点酶联免疫吸附试验（Dot-ELISA），并对比了该方法和琼脂扩散试验的检测情况，结果表明，Dot-ELISA 更敏感，且该法重复性较好。邹勇等[9]用PEDV 细胞培养物提纯的抗原，组织毒免疫获得的高免血清建立了间接ELISA 检测PEDV 抗体水平。结果表明：包被抗原浓度为1 ∶20000，酶标羊抗猪IgG浓度选用1 ∶250 为测定抗PEDV IgG抗体的最适工作浓度。田间检测结果与临床发病和预期结果一致。韩国学者Kim O 等[10]建立了可在福尔马林固定、石蜡包埋的肠组织中准确而特异的检出PEDV 的单克隆抗体基础上的免疫组化法，该方法也可用于鉴别诊断PEDV 与TGEV。但该方法对病料的前期处理比较繁琐。

5.6 反转录—聚合酶链式反应（RTPCR 法）

近年来，随着分子生物学的发展，对于PEDV 和TGEV 核酸的检测方法越来越受到人们的重视。有研究表明，RT-PCR 法是目前鉴别诊断TGEV 和PEDV 最敏感、特异的方法。传统方法诊断主要从病毒的分离与鉴定、抗原检测、电镜检测、血清学诊断等方面进行。与传统方法比较，RT-PCR 方法只需要病猪的粪便即可进行活体诊断，便于疾病的早期诊断，敏感性和特异性高，而且操作步骤更加快速、方便，一般4～6 h 内可以提供准确的结果。

Ishikawa K 等[11]根据S基因序列设计了1 对引物，成功建立了可用于检测细胞和粪便中PEDV的RT-PCR 法，此法灵敏度可达100 TCID50/mL，并可在8 h 内得出检测结果。Kubota 等[12]在N 基因的基础上，也成功建立了可进行PEDV细胞毒和粪便毒的RT-PCR 检测方法。Kim O 等[13-14]已建立了TGEV和PEDV 的 二 联RT-PCR 诊断方法，并对免疫组化、原位杂交、RTPCR 3 种方法进行了比较，结果表明RT-PCR 法检测结果的重复性最好，但当被检样品为福尔马林固定时，更适宜采用免疫组化和原位杂交法。

吴凌等[15]将猪流行性腹泻病毒分离株HLJ02，经过胰酶处理后，在Vero 细胞上增殖， 用RT-PCR 和RT-nested PCR 分别扩增出854 bp的M 全基因片段和412 bp 的M 基因部分片段，而猪传染性胃肠炎病毒和Vero 细胞培养液中未扩增出上述产物，表明RT-nested PCR 可用于检测猪流行性腹泻病毒。刘邓等对TGEV和PEDV 的二联RT-PCR 检测方法进行了改进，提高了病毒感染初期的敏感性，并建立了用于检测PEDV 的TaqMan 荧光定量RT-PCR 法，对TaqMan 荧光定量RT-PCR 法和RT-PCR 法的检测结果进行了对比和分析，结果表明普通RT-PCR 检测PEDV 存在漏检的可能，而TaqMan荧光定量RT-PCR 法具有准确、定量、污染低、灵敏度高、特异性强及省时省力等优点[16，17]。但该方法对实验操作人员以及实验条件等的要求较为严格，以及检测成本的限制，因此在推广上仍有很大的限制。

PED 与TGE 的临床症状极其相似，所以诊断非常困难。最初的实验室诊断主要依靠传统的病毒分离与鉴定、中和试验、免疫电镜、免疫荧光等病原学诊断方法，这些方法都能对PED做出准确的诊断，但是一般都只能在病猪死亡后或者早期扑杀后才能进行，而且检测前病料的前期处理比较繁琐，有的甚至要求价格高昂的实验设备或成熟的细胞培养体系，操作复杂而且耗时。随着分子生物学的发展，RTPCR 技术被应用到PEDV 诊断技术中，虽然此法敏感性和特异性都很好，但由于需要特殊的仪器设备，目前只适用于实验室诊断，不适用于临床诊断。综合考虑，直接免疫荧光法（FAT）和ELISA 相对比较方便，而且准确性比较高，目前应用最为广泛。

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