陈建飞，冯 力，时洪艳，崔尚金

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室、猪传染病研究室，黑龙江 哈尔滨 150001）

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由尼多目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状病毒属（Coronavirus）α-冠状病毒中的猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic d iarrhea virus，PEDV）引起的猪的一种急性、高度传染性的肠道疾病，该病以急性肠炎、呕吐、水样腹泻和脱水为主要特征。各种日龄的猪均易感，尤其是哺育仔猪，发病率高达100%，死亡率为30%～80%。

PED 于1971 年首次在英格兰的架子猪和育肥猪群中暴发；1978 年在比利时和英国流行性腹泻发作期间，该病被证实是由PEDV 引起的[1]。到目前为止，欧洲和亚洲的许多养猪国家都有该病的报道[2]，而北美和南美至今还未见该病的报道。1973 年，类猪传染性胃肠炎的急性腹泻首先在我国上海发生，但是直到1984 年，才经荧光抗体试验和血清中和试验证实该病的病原是PEDV[3]。到目前为止，我国已有24 个省报道了PED 的发生和流行情况。PED 主要发生在冬春季节，病毒主要通过感染猪的粪便而传播，自然感染病例大多是经口摄入而感染，粪——口途径是该病的主要传播途径。随着集约化养殖规模的不断扩大，给该病的传播创造了有利条件。目前，疫苗接种是预防和控制该病的有效手段。现结合本课题组的研究进展及国内外的相关研究进展，回顾总结一下PED 疫苗的研究情况。

1 PED组织灭活苗

1993 年本课题组的王明研究员等[4]将经接种仔猪、免疫荧光检查及与PED CV777 毒株对比试验证实为PEDV 的沪毒株（S 株）接种3～9 日龄仔猪，待典型发病后迫杀，采集小肠组织及内容物，制备PED 氢氧化铝灭活苗，填补了国内外无PED疫苗的空白。该疫苗经后海穴注射，对仔猪的主动保护率为85%，被动保护率为97.06%。接种后2 周开始产生免疫力，免疫期可达6 个月。

2 PED细胞灭活苗

由于组织灭活苗存在操作繁琐、生产成本高及质量难以控制等缺点，本课题组马思奇研究员等[5]采用在病毒培养液中加适量胰酶的培养方法，将PEDV CV777 适应于Vero 细胞，以28代毒制备氢氧化铝灭活苗，后海穴接种，对仔猪的主动免疫保护率为85.19%，被动免疫保护率为85%。通过该方法制备的PED 细胞灭活苗可用于现地PEDV 的预防与控制。

3 PED弱毒苗

虽然灭活疫苗具有安全、稳定的优点，但同时由于灭活疫苗具有需要大剂量接种或者应用浓缩抗原；免疫期短，常需强化接种；不能引起局部免疫，以致细胞免疫的作用弱；产生完全免疫力需要2 周；不利于紧急预防接种与降低疫苗费用等缺点，促进了PED 弱毒疫苗的研制。目前，PED 的商品化弱毒疫苗主要有我国的CV777 株，日本的P-5V 株和韩国的KPED-9 株、DR13株。本课题组的佟有恩研究员等[6]将适应Vero 细胞的CV777 株从90 代起进行克隆纯化，目的是稳定减弱的毒力并保持良好的免疫原性。克隆后的弱毒株仍保持良好的安全性，主动免疫与被动免疫的保护率分别达到95.92%及96.2%。稳定性试验经6 代次的返祖传代仍是稳定的，未见毒力返强，证明此弱毒株已培育成功，符合弱毒疫苗毒株的条件。日本的P-5V 株虽然没有连续传代致弱的相关报道，却在日本和韩国用于PED 的预防。韩国的KPED-9 是由从新生仔猪分离的KPEDV-9 通过Vero 细胞连续传代93 代后制备而成的；DR13 是由从患病仔猪小肠内容物分离的DR13 强毒通过Vero 细胞连续传代而成，该疫苗是韩国用于预防PED 的口服疫苗。

3 转基因植物疫苗

在病毒性腹泻的免疫机制中，黏膜免疫具有非常重要的作用。肠道黏膜分泌的IgA 抗体能抵御入侵的病原体。口服疫苗能刺激黏膜免疫，并能产生黏膜和血清保护性IgA 抗体，是预防肠道传染病的有效途径。转基因植物作为口服疫苗有可能产生理想的黏膜免疫反应，从而达到预防病毒性腹泻病的目的。2003 年，韩国Bae 等将PEDV 中和表位区域COE 基因转入到烟草，构建了表达抗原的转基因烟草。利用表达的抗原口服免疫小鼠，试验结果表明能有效地诱导产生保护宿主细胞免受PEDV 感染的体液和黏膜免疫应答。尽管在烟草中表达的PEDV 表位有抗原决定簇，但是外源抗原在烟草中表达水平低限制了转基因植物疫苗的发展，为此，2005 年，Kang 等在无尼古丁的烟草中表达了合成的PEDV 中和表位基因，外源抗原的表达量占全部可溶性植物蛋白的2.1%,大约是天然基因表达量的五倍，为可食转基因植物疫苗的研究奠定了基础。

4 乳酸杆菌疫苗

乳酸杆菌作为微生态制剂中的主要益生菌，广泛应用于食品、饲料加工业。构建乳酸杆菌质粒载体，表达在黏膜系统中增殖的病原微生物的保护性抗原基因，制备绿色环保、可食用的多功能黏膜免疫的微生态制剂疫苗应用前景广阔。而黏膜免疫恰恰是防治TGE 和PED 的主要途径。葛俊伟等[7，8]先后构建了表达PEDV N 基因和中和抗原位点的重组干酪乳杆菌，并将表达的外源蛋白口服免疫小鼠；研究结果表明表达PEDV N 蛋白的重组干酪乳杆菌和PEDV COE 蛋白的重组干酪乳杆菌具有良好的免疫原性，可以刺激肠道产生局部免疫应答，又可诱导产生系统特异性免疫应答，经口免疫小鼠能激发出特异性的体液免疫和细胞免疫；在小鼠体内显示了很好的免疫效力,为口服疫苗的研制奠定了基础。

5 二联苗

目前，在我国用于PED 预防和控制的疫苗主要是PED-TGE 二联苗。由于PEDV 和TGEV 均属于冠状病毒，而且致病机理相似，组织嗜性相同。因此，研制联苗亦是可行的。本课题组先后研制成功PED-TGE 二联灭活疫苗和PED-TGE 二联弱毒疫苗[9，10]。该二联疫苗的特点是：毒价高，后海穴接种（是对常规免疫途径的突破），增强了免疫保护力，一次接种即可，省时、省力。经国内外联机检索查新证明，该二联苗是国际领先研制成功的，并在技术上有原始创新。2 种疫苗主要用于妊娠母猪的，以被动免疫保护仔猪，也用于主动免疫保护不同日龄的猪只。其中二联灭活苗主动免疫保护率为96%，被动免疫保护率为85.1%；二联活疫苗主动免疫保护率为97.7%，被动免疫保护率为98%。2 种二联疫苗的免疫期为6 个月，仔猪被动免疫期是哺乳期至断奶后1 周。灭活疫苗在免疫后14 d 产生免疫力；二联活疫苗免疫后7 d 产生坚强的保护。

6 展望

猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒是引起猪病毒性腹泻的主要病原，而且在现地猪群中常常混合感染，给我国养猪业带来了很大的经济损失。因此，开发研制预防3 种疾病的联苗是切实可行的。本课题组冯力研究员等先后研制了“猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻与猪轮状病毒三联灭活疫苗”和“猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻与猪轮状病毒三联活疫苗”。目前，三联活疫苗在4个省的9 个猪场先后进行了不同批次疫苗的临床试验（共计45 000 头份）。临床试验各猪场反馈效果良好，区域免疫保护率超过95%，猪场病毒性腹泻发病率由原来的8%～12%下降到3%～5%，为各猪场减少了损失，提高了经济效益。这表明我们研制的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联活疫苗在预防仔猪病毒性腹泻方面效果甚佳，无副作用，是一种安全有效的疫苗，值得大规模生产，扩大使用区域的范围，加以推广。

[1] Pensaert MB, de Bouck P (1978)A new coronavirus-like particles associated with diarrhea in swine.Arch Virol. 58:243-247．

[2] Pensaert M B，Yeo S G (2006)Porcine epidemic diarrhea. In: Straw B E, Zimmerman JJ, D’Allaire S,Taylor D J (ed) Disease of Swine,9th edn. Blackwell Publishing, Ames,IA, pp 367-372

[3] 宣华，邢德坤，王殿瀛，等．应用猪胎肠单层细胞培养猪流行性腹泻病毒的研究[J]．中国人民解放军兽医大学学报，1984，4（3）：202-208．

[4] 王明，马思奇，周金法，等.猪流行性腹泻灭活疫苗的研究[J].中国畜禽传染病,1993,5:17-19.

[5] 马思奇，王明，周金法，冯力.猪流行性腹泻病毒适应Vero 细胞培养及以传代细胞毒制备氢氧化铝灭活苗免疫效力试验.中国畜禽传染病,1994（2）:15-19．

[6] 佟有恩，冯力，李伟杰．猪流行性腹泻弱毒株的培育.中国畜禽传染病，1998，20（6）：329-332．

[7] 葛俊伟，姜艳平，汪淼．表面表达猪流行性腹泻病毒核蛋白蛋白的重组干酪乳杆菌诱导产生的免疫应答．生物工程学报，2009,25（6）：813-818．

[8] 葛俊伟，姜艳平，汪淼．表达猪流行性腹泻病毒中和抗原位点的重组干酪乳杆菌免疫小鼠诱导的免疫应答．中国兽医科学，2010，40（7）:708-712．

[9] 马思奇，王明，冯力．猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻二联氢氧化铝灭活疫苗的研究．中国畜禽传染病，1995，17（6）：23-27．

[10] 佟有恩，冯力，李伟杰．猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻二联弱毒疫苗的研究．中国预防兽医学报，1999，21（6）：406-410．