王振华，刘云会，薛一雪

（中国医科大学 1.基础医学院生理学教研室，沈阳 1 1 0 0 0 1；2.附属盛京医院神经外科，沈阳 1 1 0 0 0 4；3.基础医学院神经生物学教研室，沈阳 1 1 0 0 0 1）

近年来，腺病毒载体介导的基因转移已经被广泛应用于人类疾病的基因治疗中。它具有安全性较好且转染率高等优点，但其应用在某些科学领域也存在一定的局限性，例如体外转染腺病毒载体可干扰原代培养的某类细胞的一些特定功能。有文献报道，表达β半乳糖苷酶（βgal）基因的腺病毒载体以20 MOI的剂量转染原代培养的垂体前叶细胞，将影响该细胞激素的分泌及细胞增殖［1］。在原代培养的牛肾上腺皮质等细胞中，携带某种基因的腺病毒载体也会不同程度地改变这些细胞分泌激素等功能［2］。尽管腺病毒载体已成功用于在体或离体培养的内分泌细胞的基因转移，尤其是垂体前叶细胞［3，4］，但鲜有在内分泌细胞中转染腺病毒载体效应的报道。如果腺病毒载体本身对靶细胞的功能产生影响，将使腺病毒载体的应用严重受限。因此，了解腺病毒载体和靶细胞的相互作用对于腺病毒载体的成功应用具有重要意义。本研究观察腺病毒载体对原代培养的大鼠垂体催乳素细胞增殖功能的影响，并进一步探讨其可能的分子作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

7周龄雌性Wistar ST大鼠126只，由中国医科大学实验动物部提供。腺病毒表达质粒，购自Clontech公司；磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（phosphorylated cAMP response element binding pro－tein，pCREB）抗体，购自 Cell Signaling公司；增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）单克隆抗体，购自Oncogene公司。

1.2 方法

1.2.1 腺病毒载体制备：腺病毒载体（Ad-prl/βgal、Ad-CMV/empty、Ad-CRE/Luc）的制备参照Adeno-X表达系统说明书（Clontech Laboratories，Mountain View，USA）和参考文献［5］完成。

1.2.2 垂体前叶细胞的培养及分组：Wistar ST大鼠用乙醚麻醉后断头，无菌条件下开颅取出垂体，去除后叶。将垂体前叶置于S-MBH的培养皿中，用眼科剪把前叶组织切成细小的碎片，用0.1%的胰蛋白酶消化，37℃振荡水浴40 min，用吸管吹打细胞后终止消化，细胞悬液经1 100 r/min离心10 min，弃掉上清，滴加DMEM/F12培养液，使垂体前叶细胞再悬浮分散。镜检计数后，将100 μl的2×106/ml细胞悬液滴于多聚赖氨酸处理的35 mm培养皿中，以垂体前叶细胞培养皿为观察单位，随机分为对照组（细胞未转染腺病毒载体）、Ad-βgal转染组和Ad-empty转染组（未携带外源性基因的空腺病毒载体，腺病毒载体剂量为5 MOI）3组，每组8个皿。腺病毒载体转染组先加入合适剂量的腺病毒载体于细胞悬液中混匀后，再滴入培养皿中，而后置于37℃、5%CO2孵箱中进行培养。

1.2.3 X-gal组化方法鉴定腺病毒载体转染的效果：腺病毒载体感染垂体细胞72 h，3%多聚甲醛固定10 min，PBS洗5 min，含1%Tween20的TBS孵育30 min，加入 X-gal染色液（1 mg/ml X-gal、5 mmol/L铁氰酸三钾、5 mmol/L铁氰酸四钾、2 mmol/L氯化镁溶于PBS），37℃孵育1 h，封片。计数腺病毒感染的蓝染阳性细胞率。

1.2.4 5-溴-2′-脱氧尿苷（5-Bromo-2′-deoxyuridine，BrdU）标记法检测转染腺病毒载体后的大鼠垂体催乳素细胞的增殖功能：细胞培养第3天，对照组、Adβgal转染组和Ad-empty转染组均给予200 μmol/L BrdU，培养3 h，终止培养，收集细胞，用冰甲醇固定，然后用BrdU抗体和催乳素（prolactin，PRL）抗体做双重免疫细胞荧光染色［6］，封片后用荧光显微镜观察并照相，每个玻片随机选择1 000个PRL免疫阳性细胞，计算BrdU标记指数，即PRL和BrdU均阳性的细胞占PRL阳性细胞的百分比。BrdU标记的阳性细胞呈红色荧光，定位于胞核。所用抗体如下：兔抗大鼠 PRL一抗（NIDDK IC-5，1∶4 000）/FITC标记的抗兔IgG（Amersham公司，1∶50）；小鼠多克隆抗 BrdU（Sigma 公司，1∶200）/生物素化抗小鼠IgG（Vector公司，1∶50）/Texas Red抗链霉素蛋白（Amersham 公司，1∶50）。

1.2.5 免疫荧光方法检测转染腺病毒载体的催乳素细胞中pCREB蛋白的表达：催乳素细胞分为未转染腺病毒载体（vehicle）组、胰岛素样生长因子1（insulinlike growth factor-1，IGF-1）组、Ad-empty 转染组、Adempty+IGF-1 组、Ad-βgal转染组和 Ad-βgal+IGF-1组。IGF-1处理组为细胞培养第3天加入30 ng/ml IGF-1培养3 h，然后用2%多聚甲醛固定细胞，含1%Tween20的TBS孵育细胞30 min后，3%H2O2孵育细胞10 min，封闭缓冲液封闭30 min后，用pCREB（Ser133）抗体和PRL抗体做双重免疫细胞荧光染色［7］，用Photoshop软件定量分析胞核内FITC的荧光强度，计算各组PRL免疫阳性细胞中pCREB蛋白阳性表达率。所用抗体如下：单克隆兔抗 pCREB 一抗（1∶100），FITC 标记的抗兔IgG（1∶100），辣根过氧化物酶标记的抗FITC抗体（1∶200），Tyramide-FITC（1∶50），小鼠抗 PRL 抗体（1∶30 000），Alexa Fluor 594 标记抗小鼠 IgG（1∶100）。1.2.6 荧光素酶报告基因方法检测转染腺病毒载体的催乳素细胞中cAMP反应元件（cAMP response element，CRE）基因的表达：每组在制备细胞悬液时，分别加入0.5 MOI的Ad-CRE/Luc。垂体细胞培养第3 天，用 400 μl裂解液（Promega）裂解细胞，收集细胞，4℃、15 000 r/min离心2 min，采用荧光素酶报告基因检测试剂盒测定各组中CRE元件荧光的表达水平，应用分光光度计检测各组细胞的荧光强度，以每组荧光强度倍数来反映各组细胞中CRE的荧光表达活性。

1.2.7 Western blot方法检测腺病毒载体对垂体前叶细胞中PCNA表达的影响：各组分别接种浓度为3.0×106/ml的大鼠垂体前叶细胞悬液300 μl于35 mm的培养皿中，培养3 d后，弃去培养液，PBS冲洗，加入100 μl裂解液，15 min后收集细胞，4℃、14 000 r/min离心15 min，取上清液采用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量。取各组的等量蛋白在12.5%SDS-PAGE中电泳后，转移至硝酸纤维素膜上。5%的脱脂奶粉封闭1 h后，在1∶1 000稀释的单克隆小鼠抗PCNA抗体中4℃孵育过夜，经TBS充分洗膜后，室温下与1∶8 000稀释的二抗结合 1 h，ECL 法显色。以 β-actin（1∶10 000）为内对照，所得图像用Chemi Imager 5500 V2.0软件扫描，通过Fluor Chen 2.0软件进行定量分析，测得整合光密度值（integrated density value，IDV）。

1.3 统计学分析

数据用x±s表示，采用SPSS 13.0软件进行单因素方差统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 腺病毒载体转染垂体前叶细胞效率的鉴定

X-gal染色结果显示，Ad-βgal转染组垂体前叶细胞蓝染，经KS400图像分析系统计算，报告基因βgal经腺病毒转移到垂体前叶细胞中的转染效率为（55.9±2.3）%。见图 1。

2.2 转染腺病毒载体对催乳素细胞增殖功能的影响

BrdU和PRL双重免疫荧光结果显示，催乳素细胞阳性细胞呈绿色荧光，定位于胞质；胞质呈绿色、胞核呈红色的细胞为BrdU标记阳性的催乳素细胞，垂体前叶细胞转染Ad-empty或Ad-βgal后显著增加催乳素细胞的基础增殖（P<0.01）。见图2。

2.3 转染腺病毒载体对催乳素细胞CRE元件表达的影响

CREB蛋白可与CRE元件特异性结合，发挥重要的核转录因子的作用。荧光素酶报告基因结果显示，转染Ad-empty或Ad-βgal的垂体细胞CRE元件的表达活性显著增高（P<0.01）。见图3。

2.4 转染腺病毒载体对催乳素细胞pCREB蛋白表达的影响

pCREB和PRL双重免疫荧光结果显示，催乳素细胞胞质呈红色荧光染色，pCREB阳性表达定位于细胞核，呈绿色荧光染色。胞质呈红色、胞核呈绿色的细胞为pCREB表达免疫阳性的催乳素细胞。与 IGF-1组相比，Ad-empty+IGF-1组和 Ad-βgal+IGF-1组催乳素细胞pCREB的表达活性显著增加（P<0.01）。Ad-empty 转染组和 Ad-βgal转染组pCREB的表达显著高于未转染腺病毒载体组（P<0.01）。见图 4。

2.5 转染腺病毒载体对垂体前叶细胞PCNA表达的影响

PCNA是一种相对分子量为36 kDa的细胞周期调控蛋白，Western blot结果发现与对照组相比，Ad-empty转染组和Ad-βgal转染组垂体细胞内PCNA蛋白的表达显著增强，其条带IDV值显著高于对照组（P<0.01）。见图5。

3 讨论

在基因治疗和免疫疗法中，腺病毒载体由于其转基因效率高，且容易获得高滴度和纯度的载体，愈来愈受到研究者们的重视。催乳素增高的垂体瘤是内分泌系统的常见疾病，深入研究导致催乳素细胞异常增殖的影响因素对于探究垂体瘤的病因及发病机制具有重要意义。本研究以原代培养的大鼠垂体前叶细胞为模型，深入探讨了腺病毒载体对催乳素细胞增殖功能的影响及可能的细胞内信号转导机制。本研究发现，表达βgal基因的腺病毒载体及未携带外源性基因的空腺病毒载体均明显增强催乳素细胞的基础增殖，提示腺病毒载体本身即可改变催乳素细胞的增殖功能，而且垂体前叶细胞在感染以上2种腺病毒载体后，细胞内CRE的活性及pCREB蛋白、PCNA蛋白的表达较对照组亦明显增高。

CRE元件是一段约30 bp构成的DNA片段，这段序列主要存在于许多靶基因的启动子与增强子上，而CREB作为一种重要的转录因子，被磷酸化激活以后可选择性结合CRE，刺激相关基因的转录。CREB可被诸多蛋白激酶介导的信号转导途径激活，其作用非常广泛，如促进细胞增殖、分化、存活，促进学习记忆等［8，9］。有实验证明，CREB 磷酸化以后在维持原代培养的催乳素细胞增殖功能中起重要的调节作用，下调CREB基因表达或抑制CRE转录活性可降低催乳素细胞的基础增殖［7］。本研究采用荧光素酶报告基因和定量双重免疫荧光方法发现垂体前叶细胞转染重组腺病毒载体后，可显著增强CRE的活性和pCREB的表达，因此我们推测CREB可能参与了腺病毒载体对催乳素细胞增殖功能的改变。

CREB调节的下游靶基因中包括许多与细胞增殖相关的基因如 c-fos、cyclins A、cyclins D、PCNA等，CREB被激活后可能通过上调这些基因的表达来刺激细胞的增殖［7，10，11］。PCNA 是一种细胞核内合成的分子量为36 kDa的蛋白质，其功能与DNA合成密切相关。检测细胞中PCNA的表达水平可较好地反映细胞增殖状态，尤其是对研究某些肿瘤的发生、发展及预后有一定价值。有学者发现PCNA可反映垂体腺瘤细胞的增殖活性。在本研究的Western blot结果中，垂体前叶转染腺病毒载体后，细胞内PCNA的表达亦显著增强，与pCREB的表达变化一致。在本研究中PCNA的表达增加是否是因为pCREB上调所致尚需进一步证明。

综上所述，本研究表明虽然重组腺病毒载体可以被有效地应用于垂体细胞的基因转染中，但本身也会通过上调pCREB、PCNA蛋白的表达，在一定程度上改变催乳素细胞的增殖状态，这一结果为阐明腺病毒载体和内分泌细胞之间的相互作用及指导腺病毒载体的成功应用提供了实验依据。

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