张丽梅，冯 龙，张艳敏，马 晶，赵国强，安玉会，鲍玉洲﹟

1)河南省眼科研究所分子生物室郑州450003 2)郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室郑州450001 3)郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室郑州450001

人表皮生长因子慢病毒载体的构建及表达

张丽梅1，2)，冯 龙3)，张艳敏1)，马 晶3)，赵国强3)，安玉会2)，鲍玉洲1，2)﹟

1)河南省眼科研究所分子生物室郑州450003 2)郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室郑州450001 3)郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室郑州450001

#通讯作者，男，1955年10月生，研究员，研究方向:基因治疗，E-mail:baoyuzhou@126.com

人表皮生长因子;慢病毒载体;基因构建

目的:构建人表皮生长因子(hEGF)慢病毒(LV)载体。方法:酶切并收集pcDNA 3.1-hEGF载体中的hEGF目的基因片段，克隆进入含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒载体内，将所得重组体LV-GFP-hEGF与辅助载体pΔ8.2和pVSVG共同转染人胚肾293T细胞，进行病毒包装。收集上清液，按按10-1～10-7倍比稀释后培养，检测病毒滴度;裂解细胞，进行Western Blot分析。结果:PCR扩增、HindⅢ酶切鉴定及测序结果均证实LV-GFP-hEGF构建成功。将LV-GFP-hEGF转染293T细胞，紫外光下检测可见绿色荧光;LV滴度达5×108TU/mL，转染效率＞75%，Western Blot证实转染细胞可表达hEGF。结论:成功构建了含有GFP报告基因的hEGF慢病毒载体，包装后的慢病毒可在293T细胞内高效表达。

人表皮生长因子(human epidermal growth factor，hEGF)是人体内促生长因子家族成员之一，它不仅可以刺激角膜上皮细胞、成纤维细胞及内皮细胞等多种细胞增殖分化，而且还能有效促进组织损伤的愈合。作者将hEGF基因序列插入含有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因的慢病毒载体(lentivirus vector，LV)内，完成hEGF慢病毒载体LV-GFP-hEGF的构建，并将构建的慢病毒在辅助包装病毒载体pVSVG和pΔ8.2的共同作用下转染到人胚肾293T细胞中进行表达，以便为hEGF促组织损伤修复作用机制的研究提供实验材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒与菌株 含有hEGF目的基因序列的pcDNA 3.1-hEGF真核表达载体由河南省眼科研究所分子生物室构建并保存［1］，LV-GFP、pVSVG 和pΔ8.2包装载体由美国国立卫生研究院肿瘤研究所职慧军教授惠赠，大肠杆菌DH5α由河南省眼科研究所分子生物室保存。

1.1.2 细胞 293T细胞系由河南省眼科研究所分子生物室保存。

1.1.3 主要试剂 限制性内切酶 HindⅢ、EcoRⅤ、MluⅠ、AVaⅢ及pfu DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、dNTP及大量质粒提取试剂盒均为Promega公司产品;DNA Marker为大连宝生物公司产品;低熔点琼脂糖为AMRESCO公司产品;胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒为Qiagen公司产品;胎牛血清、DMEM、6孔细胞培养板和胰蛋白酶为Gibco公司产品;磷酸钙转染试剂盒购自上海生工生物工程有限公司;HIV p24蛋白ELISA试剂盒为Zeptometrix公司产品;兔抗人hEGF IgG抗体为Santa Cruz公司产品，羊抗兔IgG抗体为武汉博士德公司产品;其他试剂均为国产分析纯以上级。

1.1.4 引物合成与设计 参照GenBank设计引物及连接子。连接子BL1、2及LV-GFP鉴定引物JDSIN1、2由金斯特科技有限公司合成，hEGF引物和T7、SP6通用引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2 hEGF慢病毒载体的构建及鉴定

1.2.1 表达载体的构建 首先将pcDNA 3.1-hEGF质粒用MluⅠ和EcoRⅤ双酶切，电泳和胶回收后得到目的片段，该片段分别含有MluⅠ酶切黏末端和EcoRⅤ酶切平末端，将此片段与 LV-GFP和 BL1、BL2连接子放在同一反应管内进行连接反应。总连接反应体系为10μL:其中含回收纯化后的目的片段6μL，BL1和BL 2单链退火产物形成的连接子1μL，LV-GFP 1μL，T4 连接酶1μL，10 × 连接buffer 1μL;对照管加入6μL超纯水代替目的片段，余同上。16℃过夜连接，得LV-GFP-hEGF。将连接产物导入DH5α感受态大肠杆菌，取菌液100μL均匀涂布于含有氨苄青霉素的LB平板，37℃培养过夜。

1.2.2 目的片段的扩增及鉴定 从含氨苄青霉素的LB平板上随机挑取单菌落，在液体LB培养基内摇床培养细菌并提取质粒，用JDSIN1和JDSIN2鉴定引物进行PCR扩增。PCR总反应体积为30μL:其中 ddH2O 18.5μL，10 × buffer 3μL，dNTP 2μL，10 μmol/L 引物各 0.5μL，pfu DNA 聚合酶0.5μL，模板5μL。PCR反应条件:94℃预变性2min;94℃变性40 s，55℃ 退火45 s，68 ℃延伸60 s，30个循环;68℃延伸5min。取PCR扩增产物5μL，于18 g/L琼脂糖凝胶电泳，判断阳性克隆。用HindⅢ对含有目的片段的质粒进行酶切鉴定。挑选经初步鉴定的重组体，送上海生工生物工程有限公司测序，将测序结果与GenBank中的hEGF序列进行比对。

1.3 hEGF慢病毒载体的表达

1.3.1 转染293T细胞 采用磷酸钙共沉淀法［2］将重组 LV-GFP-hEGF 质粒 15 μg分别与 10 μg pΔ8.2包装质粒和5 μg pVSVG包膜质粒，加水混合至总量为250μL，共转染生长良好、细胞融合度达到50%～80%的单层293T细胞，用无血清高糖DMEM培养基在37℃、体积分数5%CO2条件下培养3 h后，加入体积分数为10%的胎牛血清，连续培养12 h后更换培养液，37℃、体积分数5%CO2条件下继续培养。3种质粒在293T细胞中完成装配并形成假病毒颗粒。分别于培养24、48及72 h后荧光灯下检测培养液的荧光强度，待达到一定亮度时，收获高滴度的慢病毒颗粒。

1.3.2 病毒滴度检测 将293T细胞按照2×105个/孔接种于6孔板内，吸附6 h后，将所收集的含重组体的上清液分别按10-1～10-7倍比稀释后，每孔按0.1 mL分别加入到相应培养孔内，过夜培养后，更换培养基，分别于培养24、48及72 h后在荧光显微镜下计数荧光阳性细胞个数，计算慢病毒转染效率。超高速离心收集病毒上清液，用ELISA法对HIV病毒p24蛋白进行滴度检测［3］。

1.3.3 蛋白质分析 刮取细胞，用生理盐水漂洗3次，-80℃条件下反复冻融3次后超声粉碎，离心弃细胞碎片，从上清液中提取并纯化蛋白质，比色法测定蛋白质浓度，95℃水浴3min，4℃冷却后，120 g/L SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，以兔抗人EGF为特异性一抗、羊抗兔IgG为二抗进行Western Blot分析，观察目的蛋白的表达。

2 结果

2.1 LV-GFP-hEGF的鉴定 见图1、2。MluⅠ和EcoRⅤ双酶切pcDNA 3.1-hEGF质粒，胶回收后得到900 bp左右的目的片段，该目的片段、BL1与BL2连接子退火产物和LV-GFP 3连接后转化 DH5α感受态细菌，挑选阳性克隆，用JDSIN1和JDSIN2引物进行PCR扩增，目的片段大小为878 bp。从阳性克隆提取的质粒即LV-GFP-hEGF，用HindⅢ酶切鉴定，所得目的片段大小约为600 bp。将测序结果与GenBank中的hEGF序列进行比对，确认序列无误。

2.2 LV-GFP-hEGF转染效率及病毒滴度测定转染239细胞24、48及72 h后，病毒转染效率分别为(75.0 ± 4.1)%，(88.0 ± 4.0)% 和(87.4 ±4.0)%。转染72 h后，细胞不再贴壁生长，此时收集细胞上清液，用ELISA法针对HIV病毒p24蛋白检测病毒滴度为5×108TU/mL。

2.3 转染细胞中hEGF蛋白的表达 Western Blot结果显示转染细胞中存在hEGF蛋白的表达，hEGF相对分子质量约为6 000。

3 讨论

在多种内源性生长因子中，EGF对皮肤、角膜和胃肠道等组织的损伤修复过程均起着重要作用。通过外源性补充hEGF可显著促进皮肤、角膜及胃肠道等多种组织的损伤修复［4-7］。但由于EGF为小分子蛋白质，半衰期短，仅1.5～3.5 h，在体内易降解，需连续给药方能保证有效的药物浓度。因此如果选用合适的载体将hEGF基因直接导入机体组织损伤部位，使hEGF在受损伤部位组织细胞中持续分泌新鲜的EGF蛋白，对损伤部位组织细胞直接进行持续性治疗，必将有利于创面的愈合。

用人工构建的方法剔除HIV-1的env、gag、pol和nef等致病基因区后，将保留下来的HIV-1其余部分序列构建成LV，这种LV对人体已不具有传染性，它只有在包膜质粒pVSVG和包装质粒pΔ8.2共同作用下转染宿主细胞，才能装配成假病毒颗粒。其中Δ8.2能够提供假病毒装配所必需的全部反式激活蛋白;VSVG编码VSV-G包膜，应用此包膜的LV拓宽了载体的嗜性范围，增加了载体的稳定性。在LV载体包装过程中，宿主细胞能提供产生假病毒颗粒的必需蛋白。用LV作为载体具有如下特点:①将外源目的基因整合到宿主细胞基因组中，能长期表达而不丢失。②容量大，可携带高达8 000 bp左右的外源基因，因此大多数目的基因都能被克隆入LV。③免疫原性低，不容易引起体内强烈的免疫反应［8-9］。④可以兼容多种转录启动子，其中包括细胞特异性启动子等，应用组织特异性启动子和增强子来驱动LV中的外源基因，可使其在特定的组织细胞中表达，为慢病毒介导的基因靶向治疗提供理论基础。⑤转染效率高，对一般真核细胞的转染效率均可达到80%以上。正是由于LV的以上特点，使得它越来越受到人们的重视，成为最有希望用于临床基因治疗的载体之一。

作者的研究结果显示成功构建了转染效率高的LV-GFP-hEGF，其可在293T细胞内高效表达hEGF蛋白，这对随后进行的角膜损伤疾病的基因治疗具有重要指导意义。

［1］赵国强，张立华，王莉，等.人表皮生长因子真核表达载体的构建［J］.郑州大学学报:医学版，2004，39(4):603

［2］孙兵，惠国桢，郭礼和，等.慢病毒介导GDNF对帕金森病的多巴胺能神经营养作用［J］.生物化学与生物物理学报，2003，35(10):937

［3］Bemelmans AP，Kostic C，Crippa SV，et al.Lentiviral gene transfer of RPE65 rescues survival and function of cones in a mouse model of leber congenital amaurosis［J］.PLoS Med，2006，3(10):e347

［4］Sharma K，Babu PV，Sasidhar P，et al.Recombinant human epidermal growth factor inclusion body solubilization and refolding at large scale using expanded-bed adsorption chromatography from Escherichia coli［J］.Protein Expr Purif，2008，60(1):7

［5］Liu Y，Petreaca M，Yao M，et al.Cell and molecular mechanisms of keratinocyte function stimulated by insulin during wound healing［J］.BMC Cell Biol，2009，10:1

［6］Liang P，Jiang B，Huang X，et al.Anti-apoptotic role of EGF in HaCaT keratinocytes via a PPARbeta-dependent mechanism［J］.Wound Repair Regen，2008，16(5):691

［7］Stout JT.Gene transfer for the treatment of neovascular ocular disease(an American Ophthalmological Society thesis)［J］.Trans Am Ophthalmol Soc，2006，104:530

［8］Naldini L，Blömer U，Gallay P，et al.In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector［J］.Science，1996，272(5 259):263

［9］Cudré-Mauroux C， Occhiodoro T， Konig S， etal.Lentivector-mediated transfer of Bmi-1 and telomerase in muscle satellite cells yields a duchenne myoblast cell line with long-term genotypic and phenotypic stability［J］.Hum Gene Ther，2003，14(16):1 525

(2009-07-06收稿 责任编辑王 曼)

Construction and expression of lentivirus vector for human epidermal growth factor

ZHANG Limei1，2)，FENG Long3)，ZHANG Yanmin1)，MA Jing3)，ZHAO Guoqiang3)，AN Yuhui2)，BAO Yuzhou1，2)
1)Laboratory of Molecular Biology，Henan Eye Institute，Zhengzhou 450003 2)Department of Biochemistry and Molecular Biology，College of Basic Medical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001
3)Department of Microbiology and Immunology，College of Basic Medical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001

human epidermal growth factor;lentivirus vector;gene construct

Aim:To construct lentivirus vector(LV)of human epidermal growth factor(hEGF).Methods:hEGF target sequence in pcDNA-hEGF 3.1 vector was cut，extracted and inserted into LV which contained green fluorescence protein(GFP)gene，then the recombinant LV-GFP-hEGF was cotransfected into human embryonic kidney 293T cells along with assisting vectors pΔ8.2 and pVSVG to package the virus.The supernatant was extracted，attenuated according to different titer，and cultivated，the virus titer was detected，and the cells were clearaged and analyzed with Western Blot.Results:LVGFP-hEGF was constructed successfully，and could express in 293T cells.The virus titer was 5 ×108TU/mL.Conclusion:LV which contained GFP and hEGF gene has been constructed successfully，and the packaged lentivirus could express effectively in 293T cells.

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