时晓芳，闫红霞，宋安营，高艳锋，祁元明，汲振余，郭 欢，任 岩，康巧珍#

1)郑州大学生物工程系郑州450001 2)河南省医药科学研究院郑州450052

稳定转染pEGFP-4.1N乳癌细胞系的筛选与鉴定*

时晓芳1)，闫红霞1)，宋安营1)，高艳锋1)，祁元明1)，汲振余2)，郭 欢1)，任 岩1)，康巧珍1)#

1)郑州大学生物工程系郑州450001 2)河南省医药科学研究院郑州450052

#通讯作者，女，1965 年4 月生，博士，教授，研究方向:蛋白4.1 与肿瘤，E-mail:qzkang@zzu.edu.cn

乳癌;4.1N;增强型绿色荧光蛋白;真核表达载体;MDA-MB-231

目的:建立真核表达载体pEGFP-4.1N稳定转染的乳癌MDA-MB-231细胞系，观察4.1N在MDA-MB-231细胞中的表达和定位。方法:真核表达载体pEGFP-4.1N转化到大肠杆菌中进行扩增，酶切鉴定插入片段后进行测序。脂质体法将重组质粒转染至MDA-MB-231细胞中，经G418筛选抗性克隆，利用倒置荧光显微镜观察融合蛋白在细胞中的定位，并用Western blot检测融合蛋白的表达。结果:真核表达载体pEGFP-4.1N的酶切片段经琼脂糖电泳和测序鉴定结果正确。G418筛选14 d后获得pEGFP-4.1N稳定转染的MDA-MB-231抗性克隆。荧光显微镜下观察到融合蛋白在MDA-MB-231阳性克隆的细胞质中表达，核内不表达。Western blot亦检测到4.1N融合蛋白的表达。结论:成功建立了pEGFP-4.1N稳定转染的乳癌细胞系MDA-MB-231阳性克隆。

蛋白 4.1 家族，包括 4.1R、4.1G、4.1B 和 4.1N 4 个成员［1］。近年来，越来越多的研究［2-6］发现，4.1蛋白在多种肿瘤组织中存在不同程度的表达缺失或下调，提示蛋白4.1与肿瘤的发生和发展密切相关。作者用4种蛋白4.1特异抗体对3株不同转移力乳癌细胞MC-F7、T-47D和MDA-MB-231进行 Western blot和细胞免疫荧光筛检，发现相对分子质量为100 000的蛋白 4.1N在高转移乳癌 MDA-MB-231细胞中不表达，作者将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)与 4.1N 的融合基因真核表达载体 pEGFP-4.1N转染 MDAMB-231，通过G418筛选得到EGFP-4.1N稳定表达的MDA-MB-231细胞，为进一步研究蛋白4.1N对乳癌发生、发展的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、菌种及质粒 高转移乳癌MDA-MB-231细胞购于美国菌种保藏中心，大肠杆菌DH5α株、DH5α感受态细胞和pEGFP-4.1N质粒均为郑州大学生物工程系保种、制备和构建，pEGFP-C3由美国纽约血液中心安秀丽博士惠赠。

1.2 主要试剂 兔抗4.1N HP［Head Piece］多克隆抗体(美国纽约血液中心安秀丽博士惠赠)，OPTI-MEM、LipofectamineTM2000 购自 Invitrogen，EcoRⅠ、SalⅠ限制性内切酶和蛋白质Marker购自宝生物工程(大连)有限公司，G418购自Inalco公司，小量质粒提取试剂盒购自TaKaRa公司，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记羊抗兔二抗购自Jackson Immuno Research公司，GAPDH抗体购自英国Abcam公司，ECL发光试剂盒购自Thermo公司，DMEM购自Gibco公司，新生牛血清购自杭州四季青公司。

1.3 真核表达载体pEGFP-4.1N的提取和鉴定于超净台内将1μL pEGFP-4.1N质粒和pEGFP-C3质粒分别与60μL感受态DH5α细胞混合，冰浴5～10min，42℃水浴90 s(同时用DH5α细胞作转化对照)，于超净工作台内分别向上述3个Eppendorf管中加入100μL LB液体培养基，37℃水浴45min。将上述孵育细胞移入含氨苄青霉素的LB筛选培养平板，用L棒均匀涂布。37℃培养过夜。在超净工作台中分别挑取转染pEGFP-4.1N质粒和pEGFPC3质粒的单个氨苄青霉素抗性菌落，分别接种于5 mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振摇(200 r/min)过夜培养。次日，取1.5 mL菌液移至Eppendorf管内，按照小量质粒提取试剂盒操作步骤提取质粒，在260和280 nm下测吸光度，计算质粒的纯度和浓度。对PEGFP-4.1N质粒进行EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定，同时用pEGPFP-4.1N和pEGFP-C3 EcoRⅠ单酶切作对照。经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像分析仪观察分析结果。将pEGFP-4.1N阳性质粒送北京三博远志生物技术有限责任公司进行测序鉴定。

1.4 乳癌MDA-MB-231细胞的培养与转染 用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养24 h，细胞呈贴壁性生长。采用LipofectamineTM2000试剂按照说明书进行细胞转染，同时设置pEGFP-C3空质粒转染和未转染MDA-MB-231细胞为对照组，每组3个复孔。

1.5 稳定细胞系的筛选 将MDA-MB-231细胞接种于24孔板，待80%融合时分别加入终质量浓度为 0、100、200、400、500、600、700 和 800 mg/L 的G418，3 d换1次相同质量浓度G418的培养液，筛选14 d，以细胞全部死亡的最低G418质量浓度为最佳筛选剂量。重组质粒pEGFP-4.1N转入MDAMB-231细胞48 h后，进行细胞传代，并更换含G418的DMEM培养液进行筛选，每隔3 d更换培养基1次。2周后筛选出具有G418抗性的乳癌细胞克隆MDA-MB-231细胞。经胰蛋白酶消化细胞后传代，扩大培养。

1.6 稳定细胞系的鉴定

1.6.1 蛋白4.1N表达定位的荧光蛋白示踪技术观察 将获得稳定转染pEGFP-4.1N及pEGFP-C3的MDA-MB-231细胞分别置于倒置荧光显微镜下进行观察，确定融合蛋白的亚细胞定位。

1.6.2 EGFP-4.1N 融合蛋白表达的 Western blot鉴定 将获得稳定转染pEGFP-4.1N及pEGFP-C3的MDA-MB-231细胞传代培养，收集细胞，SDS-PAGE电泳分离总蛋白，电泳结束后转膜，5 g/L脱脂奶粉封闭2 h，4.1N HP抗体以TBST缓冲液(工作浓度为1∶500)稀释，加入封有硝酸纤维素膜的杂交袋中，去除所有气泡，4℃振摇过夜。第2天以TBST缓冲液洗膜3次，10min/次，加入HRP标记的羊抗兔二抗(1∶5 000)，室温下振摇1 h，以TBST缓冲液洗膜3次，10min/次。将化学发光试剂盒中的2种试剂按体积比1∶1的比例混合，在暗室中与硝酸纤维素膜反应1min。用滤纸吸干膜上的液体，保鲜膜包好，用感光胶片在压片盒中曝光，曝光后的胶片在显影液中显影约30 s，定影液中定影1min，用水冲洗后晾干。硝酸纤维素膜洗脱抗体后用GAPDH抗体替代4.1N HP抗体作内参重复上述步骤。

2 结果

2.1 pEGFP-4.1N 质粒的鉴定 pEGFP-4.1N 质粒质量浓度为0.28 mg/L，pEGFP-C3质粒为0.30 mg/L。pEGFP-4.1N表达载体的酶切鉴定结果见图1，酶切鉴定正确的pEGFP-4.1N质粒经测序后Blast鉴定序列及插入方向正确。

图1 重组真核表达载体pEGFP-4.1N的酶切鉴定图谱1:pEGFP-4.1N EcoRⅠ/SalⅠ双酶切产物;2:pEGFP-4.1N EcoRⅠ酶切产物;3:pEGFP-C3 EcoRⅠ酶切产物;M:DNA Marker。

2.2 稳定细胞系的鉴定 见图2～3。由图2可知转染pEGFP-4.1N的MDA-MB-231细胞在细胞质有较亮的荧光分布，而转染pEGFP-C3的MDA-MB-231细胞在整个细胞都可见有弥散性绿色荧光蛋白表达，说明融合蛋白EGFP-4.1N在乳癌细胞MDAMB-231中定位于细胞质，核中不表达。Western blot结果显示用兔抗4.1N特异抗体检测稳定转染pEGFP-4.1N的MDA-MB-231细胞，可检测到4.1N融合蛋白的表达，而转染pEGFP-C3空质粒和未转染的对照细胞则无相应的条带。

3 讨论

恶性肿瘤的浸润和扩散是从细胞与细胞之间的黏附以及细胞与基质间相互作用调节的失控开始的。细胞黏附分子是肿瘤转移系统的重要因素之一，其在细胞膜上的分布与功能依赖细胞骨架成分来完成。细胞膜蛋白和细胞骨架蛋白通过连接蛋白形成蛋白聚合体，从而维持细胞的形状、细胞间的黏附、细胞与基质间的黏附以及细胞间的连接，还在细胞间信号传导过程中扮演重要角色。

蛋白4.1家族就是这样一类连接蛋白，它能够与多种不同家族的黏附分子结合(TSLC、CD44和βcatenin等)，并参与连接复合体的组成［7-9］。目前发现的与蛋白4.1家族膜结合结构域FERM高度同源的超家族成员已有40多个，它们中有许多已被证实与肿瘤的发生与转移相关，如蛋白4.1R的FERM结构域被证实与CD44结合，CD44已被证实在很多肿瘤的转移中发挥作用［10］。有学者［3-6］用免疫组织化学方法对临床标本筛查，发现蛋白4.1N在食管小细胞癌、结肠癌、胃癌和非小细胞肺癌中表达减少，提示4.1N可能也参与肿瘤的发生和发展。

乳癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率呈明显上升趋势。乳癌治疗失败的主要原因是其局部浸润和向重要脏器的远处转移。作者利用绿色荧光蛋白示踪技术构建了4.1N真核表达载体，转入MDA-MB-231细胞并筛选出稳定表达4.1N的MDA-MB-231细胞系，为探究4.1N表达与乳癌发生、发展及转移机制方面的研究奠定了基础。

［1］ Kang Q，Wang T，Zhang H，et al.A Golgi-associated protein 4.1B variant is required for assimilation of proteins in the membrane［J］.J Cell Sci，2009，122(8):1 091

［2］Rajaram V，Gutmann DH，Prasad SK，et al.Alterations of protein 4.1 family members in ependymomas:a study of 84 cases［J］.Mod Pathol，2005，18(7):991

［3］高艳锋，祁元明，宋英，等.食管小细胞癌组织中4.1蛋白家族的表达及意义［J］.山东医药，2008，48(15):41

［4］Kikuchi S，Yamada D，Fukami T，et al.Promoter methylation of DAL-l/4.1B predicts poor progrosis in non-small cell lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2005，11(8):2 954

［5］高艳锋，翟明霞，宋英，等.肺小细胞癌组织中4.1蛋白家族的表达［J］.郑州大学学报:医学版，2008，43(4):651

［6］Wong SY，Haack H，Kissil JL，et al.Protein 4.1B suppresses prostate cancer progression and metastasis［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(31):12 784

［7］Salomao M，Zhang X，Yang Y，et al.Protein 4.1R-dependent multiprotein complex:new insights into the structural organization of the red blood cell membrane［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(23):8 026

［8］McCarty JH，Cook AA，Hynes RO.An interaction between αvβ8 integrin and Band 4.1B via a highly conserved region of the Band 4.1 C-terminal domain［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(38):13 479

［9］Zhou Y，Du G，Hu X，et al.Nectin-like molecule 1 is a protein 4.1N associated protein and recruits protein 4.1N from cytoplasm to the plasma membrane［J］.Biochim Biophys Acta，2005，1 669(2):142

［10］Fukatsu K，Bannai H，Inoue T，et al.4.1N binding regions of inositol 1，4，5-trisphosphate receptor type 1［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，342(2):573

(2009-06-17收稿 责任编辑赵秋民)

Screening and identification of stable pEGFP-4.1N transfected breast cancer cell line

SHI Xiaofang1)，YAN Hongxia1)，SONG Anying1)，GAO Yanfeng1)，QI Yuanming1)，JI Zhengyu2)，GUO Huan1)，REN Yan1)，KANG Qiaozhen1)
1)Department of Bioengineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001 2)Henan Academy of Medical and Pharmaceutical Sciences，Zhengzhou 450052

breast cancer;4.1N;enhanced green fluorescent protein;eukaryotic expression vector;MDA-MB-231

Aim:To establish the stable pEGFP-4.1N transfected breast cancer cell line MDA-MB-231 and to study the 4.1N protein expression and its subcellular location in this cell line.Methods:Eukaryotic expression vector pEGFP-4.1 N was transformed and amplified in E.coli，followed by sequencing after enzyme digestion identification.The pEGFP-4.1N vector was transfected into MDA-MB-231 cell line with LipofectamineTM2000 and positive cell clones were screened with G418.The fusion protein expression of 4.1N in stable transfected breast cancer cells was tested by Western blot，and the GFP-4.1N subcellular location was observed with inverted fluorescence microscope.Results:Sequencing and enzyme digestion identification showed that eukaryotic expression vector pEGFP-4.1N had been successfully established.Stable pEGFP-4.1N transfected breast cancer cell line MDA-MB-231 was obtained 14 days after G418 screening.The immunofluorescence showed that GFP-4.1N protein was mainly localized in the cytoplasm.No nucleus protein expression was observed.The 4.1N fusion protein could be detected by Western blot in MDA-MB-231 cells.Conclusion:The stable pEGFP-4.1N transfected breast cancer cell line MDA-MB-231 has been successfully established.

R737.9

*国家自然科学基金资助项目 30972707，30873002;国家大学生创新性实验基金资助项目 091045922