田泱源 李瑞芳

（河南工业大学生物工程学院，郑州 450001）

粮食微生物检测技术与防制措施*

田泱源**李瑞芳

（河南工业大学生物工程学院，郑州 450001）

对目前最新检测和鉴定粮食微生物的方法及原理、粮食微生物防制措施进行总结，以期为粮食储藏提供指导。

粮食微生物；微生物检测；防制措施

粮食微生物是指寄附在粮食和食品上的微生物的统称，包括细菌类中的真细菌和放线菌，真菌类中的霉菌、酵母菌以及病毒等，这些微生物寄附在粮食及其制品的表面和内部。粮食中含有丰富的碳水化合物、蛋白质等营养物质，一旦条件合适，微生物就会通过分泌水解酶，将粮食中的营养物质分解，破坏粮食的组织结构，甚至会在粮食中产生具有强烈毒性和致癌性的毒素，引起粮食产后严重损失。因此了解当前粮食微生物监测体系和防制措施，对有效减少粮食产后损失是十分必要的。

1 粮食微生物检测技术

粮食微生物检测包括定量和定性两个方面，定量是指粮食中微生物的数量测定；而定性是根据微生物表现的各种性状特征，对微生物的种类进行鉴别。

传统的检测技术主要以分离纯化培养为基础，在细胞水平上从形态特征、生化反应等方面鉴别微生物；新的检测技术包括分子生物学技术、免疫技术、代谢技术、气相色谱等技术，使粮食微生物检测技术向快速、灵敏、特异的方向发展。

1.1 传统的检测方法

1.1.1 粮食微生物的分离培养和接种鉴定技术

这是微生物检测鉴定最常用的技术之一，他利用微生物群体特征进行检测鉴定。尤其对于形态相对较复杂的霉菌，往往有一些区别于其他种类的突出特征，一般可以借助形态特征进行种群鉴定。

由于其简便易行，对设备要求不高，因此分离培养技术是最常用的技术，但其最大的缺点就是需要的周期比较长，检测的结果具有不准确性。

1.1.2 电子显微镜检测技术

电子显微镜又分透射电镜和扫描电镜，透射电镜多用于粮食微生物形态的观察，扫描电镜主要用于细菌和真菌孢子表面形态特征观察。但是这些技术都需要昂贵的设备，广泛应用尚有难度。

1.2 分子生物学技术

1.2.1 DNA探针技术

DNA探针技术又称分子杂交技术，是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，对某一特异性DNA序列进行探查的新技术。应用不同病原微生物的DNA探针，进行相应病原微生物的检测。如Chen JC等将食品病原菌Listeria monocytogenes的特异DNA序列经过荧光标记后作为探针，检测Listeria monocytogenes病原菌，而其他李斯特菌种不能被检测，因此，避免了其他菌对结果的干扰。目前，DNA探针技术已经在沙门氏菌、产肠毒素大肠杆菌及乙型肝炎病毒等检测中得到了应用。但是采用DNA探针技术检测微生物无法区别粮食中的死菌和活菌，得到的结果对粮食微生物堆集程度的判断会有一定的偏差。

1.2.2 多聚酶链式反应（PCR）

PCR的基本原理是在体外对特定的双链DNA片段进行高效扩增，故又称基因体外扩增法。利用PCR精确、微量的优点对某些微生物特异基因进行扩增，以确定粮食中是否受到这些微生物的污染。现在广泛利用的有反转录PCR（Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction，RT-PCR） 和荧光定量PCR等。RT-PCR是利用信使RNA（mRNA） 为模板，应用反转录酶，在4种dNTP存在条件下，合成出DNA链，并利用DNA聚合酶将其进一步大量扩增的技术。相对于PCR技术只能检测病原菌染色体来说，RT-PCR检测的是病原菌的mRNA，即检测活菌的存在。荧光定量PCR又称实时定量PCR（Real-Time PCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累来实时监测整个PCR过程和PCR产物的量，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光PCR技术与传统的PCR相比，可检测mRNA含量水平，由此可判断出特定基因的转录水平。

D'Souza DH等利用荧光定量RT-PCR检测沙门氏菌侵袭宿主相关基因invA的mRNA水平，判断食品中致病性沙门氏菌活菌的存在及其侵染能力。蒋鲁岩等为同时测定粮食中的副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌，建立了基于TaqMan探针的双重Real-time（实时）PCR方法。该方法对2种细菌菌液的检测敏感度均低于10 cfu/PCR反应体系，相关系数均为1.00，整个试验可在2 h内完成。

1.2.3 基因芯片技术

基因芯片技术是将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品DNA经PCR扩增后制备荧光标记探针，然后再与芯片上寡核苷酸点杂交，最后通过扫描仪定量分析荧光分布模式，来确定检测样品中是否存在某些特异微生物。基因芯片技术理论上可以在一次实验中检出所有潜在的致病菌，也可以用同一张芯片检测某一致病菌的各种遗传学指标。

基因芯片技术需要特殊的检测设备，易污染，这也降低了他在实际工作中的应用，因此又构建了一种新的纳米金基因芯片。直径为纳米范围的金颗粒或含金的化合物，具有良好的生物兼容性，对其进行修饰后就能标记到特定的核酸上，作为信号报告分子使用，化学性质稳定，且与银反应后可形成比原来体积大106倍的黑色颗粒，可以用肉眼观察或用普通装置记录。因此，纳米金基因芯片技术大大提高了基因芯片的灵敏度和适用性。

1.3 免疫技术

1.3.1 乳胶凝集反应

乳胶凝集反应是利用抗原与抗体特异性结合的特性，加上人工大分子的乳胶颗粒，发生肉眼可见的凝集反应。用该方法制成的试剂盒检测金黄色葡萄球菌，1 min就可以发生凝集反应。该方法实验设备要求低、灵敏度和特异性均较高，适用于定性检测。

1.3.2 酶联免疫法（ELISA）

ELISA是把抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用有机结合起来的一种检测技术，既可测抗原，也可测抗体。ELISA用固相载体吸附抗体（抗原），加待测抗原（抗体），再与相应的酶标记抗体（抗原）进行抗原抗体的特异免疫反应，生成抗体（抗原） -待测抗原（抗体） -酶标记抗体（抗原）的复合物，最后再与该酶的底物反应生成有色产物，通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中待测物质含量。陈福生等以曲霉特异性抗体为材料，运用酶联免疫法对几种粮食曲霉的多糖进行检测，并和平板计数法的曲霉菌落数进行比较，结果表明两者有很好的线性关系。该方法实验设备要求低，灵敏度和特异性均较高，可进行定性和定量检测。

1.3.3 免疫磁性微球

免疫磁性分离方法，是将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面，与样品中被检致病微生物发生特异性结合，载有致病微生物的磁性颗粒在外加磁场的作用下，向磁极方向聚集，弃去检样混合液，使致病微生物不但得到分离，而且也得到浓集，达到了检测和鉴定微生物的目的。刘琳琳利用免疫磁性微球1h内就可以分离检测出金黄色葡萄球菌和链球菌，且稳定性好，成本低，可以在微生物检测方面得到广泛的应用。

1.4 代谢技术

代谢技术主要包括生物发光技术、电阻抗技术、放射测量技术、微热量技术。这些技术都是通过测量微生物新陈代谢过程中一些特殊现象和物理量的变化来检测微生物的含量。生物发光技术利用ATP是荧光素酶发光的必需底物且呈线性关系来测定ATP的含量，而微生物的特定生长时期其ATP含量恒定，因此可以通过发光强度来确定微生物的含量。电阻抗技术的原理是细菌在生长繁殖的过程中会将大分子电惰性物质如多糖、蛋白质分解为小分子具有电活性的物质，我们可以通过检测电阻抗的变化来判定细菌的生长繁殖特性。放射测量技术是通过测定引入的放射性14C标记来判断细菌的数量。微热量技术是通过测定细菌生长时热量的变化进行细菌的检出和鉴别。

1.5 气相色谱技术

气相色谱法是英国生物学家Martin等人于1952年创立的一种物理及物理化学的分离分析方法。他是一种以气体为流动相，采用冲洗法的柱色谱分离技术，并与适当的鉴定手段相结合的一种分离分析方法。其特点是高选择性、高分离效能、高灵敏度、高速度以及应用范围广。采用气相色谱法可以通过分析细菌的细胞成分、体外培养的代谢物等来检测和鉴定微生物。

Schmidt H等采用气相色谱对大肠杆菌、藤黄微球菌和巨大芽孢杆菌进行检测，试验结果显示，在保留时间1.5 min～28 min内，每种菌都有15种特定物质，这些物质的峰大多分布在这段保留时间内，但大约有一半大肠杆菌裂解产物的峰保留时间大于20 min。根据细菌裂解产物的图谱分析，即可进行菌种鉴定。Maddula S等利用气相色谱技术测量细菌分泌的易挥发性代谢物的量来确定大肠杆菌的数量。

1.6 毛细管电泳技术

毛细管电泳是泛指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道。依据样品中各组分之间淌度和分配行为的差异而实现分离的一类分离技术。毛细管电泳与传统的平板电泳方法相比，具有分离柱效高、分析速度快、自动化程度高、分析对象广、分离模式多等特点。毛细管电泳已广泛应用于食品微生物的分析检测中，与气相色谱方法相比，具有样品前处理相对简单、无需提取物和方法发展相对快等优势。

毛细管电泳技术能将细菌当作“离子”看待。细菌在一定的生理条件下，其表面基团的电离状态和双电层的厚度是电泳缓冲液种类、pH值、离子强度和温度等参数的函数，可以通过优化这些参数分离不同种类的细菌。毛细管电泳理论指出，分离柱效随样品分子扩散系数或分子量的增大而上升，这就预示着毛细管电泳在细胞分离中具有独特的优势。Law SW等利用毛细管电泳技术检测食品中的大肠杆菌，比其他的方法均节约时间。

1.7 微生物自动检测仪

随着微生物快速检测技术的不断发展，很多检测技术日趋成熟和完善，并被人们进一步开发研制成自动或半自动微生物检测仪。比如最新研制的霉菌快速检测装置就可以检测粮食中微生物数量的变化。其基本原理是当霉菌等微生物在粮食中活动时，随着微生物数量的增加，酶的活性将提高，利用新研制的检测仪可以检测粮食样品中酶活性的变化，即可快速检测和判断出粮食中微生物活动的状况。而且研究表明，仪器检测结果与粮食中实际微生物数量变化具有很强的线性相关。检测仪最大的优点是可以避免死菌对于结果的影响，因为死菌是不能产酶的，而酶活力与微生物的数量是显著相关的，所以仪器检测的结果与储藏粮食中的实际微生物数量变化具有很强的线性相关性。利用仪器检测的缺点是无法分辨微生物的种类。

2 粮食微生物的防制措施

粮食发生霉变，不仅影响粮食容重（即粮食所含的能量），而且严重地影响粮食的品质，甚至使粮食丧失食用价值，因此预防粮食微生物引起的损失主要是防止粮食发生霉变。防止霉变的措施主要有：

2.1 控制环境温度

环境温度对霉菌的生长、繁殖及存活有着极为重要的作用。各种霉菌均有其最适宜生长发育的温度范围，在此温度下霉菌代谢强度高、生长旺盛、繁殖迅速。当超过最低或最高温度界限时，其代谢便会受到抑制，以致停止生长或死亡。如曲霉生长最适温度一般在30℃左右。一般说来，粮温在20℃～40℃是大多数微生物生长的适宜温度；当温度为5℃～15℃，则生长发育缓慢，甚至停滞。因此控制粮堆温度是防霉的重要措施之一。控制温度是比较容易实现的一种预防措施，已经被广泛的应用。

2.2 控制环境水分

储粮环境中水分条件包括大气、仓房和粮堆的相对湿度、粮食含水量或水活度（AW）。水分是生物细胞的主要成分之一，微生物的新陈代谢必需有水的参加。水分是微生物生长繁殖的基本条件，各种微生物生长的最低水活度（AW）为：一般细菌0.90；一般酵母0.88；一般霉菌0.80；一些干生性霉菌0.65。粮食上曲霉属霉菌孢子萌发最低AW值为0.65～0.78；青霉属霉菌为0.79～0.81。一般说来、粮食水分降至13%以下AW为0.65，才能完全抑制霉菌的活动。因此可以通过控制环境的水分来抑制霉菌的生长繁殖。

2.3 气体成分

绝大多数霉菌是好氧的，在低氧环境下霉菌生长速度大为减弱。要达到完全抑制霉菌生长，粮堆氧体积分数必须控制在0.2%左右。有人研究当粮堆CO2体积分数达40%以上时，对一些霉菌的发育有抑制作用，在体积分数80%的CO2气体中，白曲霉、黄曲霉、黑曲霉、杂色曲霉和青霉的生长可完全抑制，而且也可抑制一些酵母菌的生长。

因此可以人为地排除粮堆中原有气体，引入某些惰性气体如CO2、N2以及这些气体的混合物，使得粮堆内氧含量降低，霉菌在低氧或绝氧情况下就会停止生长或受到抑制。在国外，气调储藏已作为现代储粮的一种重要方法。

3 展望

民以食为天，食以安为先。面临严峻的粮食安全问题，快速、有效的微生物检测技术和方法是解决这一问题的关键。目前的粮食微生物检测技术都有各自的优缺点和适用范围，如有的技术经济适用，但是耗时太长，使用受到限制；有的技术灵敏度高、特异性好、方便快捷，但由于需要精密昂贵的仪器和专业技术，目前不能普及应用。目前，国外多应用气相色谱、液相色谱、毛细管电泳等技术检测粮食微生物。这些技术灵敏度高、特异性强，但由于所需仪器设备昂贵，在国内应用较少。因此，寻找新的方便、快捷并可广泛应用的检测方法仍是研究的热点。

目前，虽然已能通过降低水分含量、补充惰性气体和控制环境温度来实现固定储粮粮仓微生物的控制。但在粮食进出口和运输过程中，火车、汽车、轮船等运输工具由于缺少相应的技术设备，粮食霉变严重。因此，加强粮食运输过程中简易防霉技术的研究仍具有重要意义。

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Detection technologies and prevention methods offood and grain microorganism

TIANYang-yuan**LI Rui-fang
（College ofbioengineering，Henan universityoftechnology，Zhengzhou 450001，China）

In order to provide valuable advising for food and grain storege，an overview of technologies and their principles of food and grain microorganism detection and identification was given and the prevetion methods were summarized.

food and grain microorganism；microbiological detection technolgy；prevention method

河南省高等学校青年骨干教师资助计划（2008051）**田泱源，男，1987年出生，在读硕士研究生，研究方向为微生物学。

2010-09-02