张小明 贾艳青 许春潮 牟德华*

1（河北科技大学生物科学与工程学院，石家庄 050018）2（定兴县质量技术监督检验所，定兴 072650）

·综述评论·

类胡萝卜素纯化及分析技术最新研究进展

张小明1*贾艳青2许春潮2牟德华1**

1（河北科技大学生物科学与工程学院，石家庄 050018）2（定兴县质量技术监督检验所，定兴 072650）

类胡萝卜素是一类重要的天然色素的总称，随着现代分析检测技术的快速发展，发现了越来越多的类胡萝卜素。通过对类胡萝卜素的分析检测技术如液相色谱法、质谱法等以及前处理纯化方法如膜分离技术、高速逆流色谱技术等进行总结，以期为今后进一步研究类胡萝卜素的结构及性质提供方便。

类胡萝卜素；纯化；分析技术

类胡萝卜素是一类重要的天然色素，此外还具有许多重要的生理功能，如抗氧化、防癌、利于心血管和眼睛健康。类胡萝卜素主要分为胡萝卜素和叶黄素两大类，几种常见的类胡萝卜素有番茄红素、玉米黄素、全反式-β-类胡萝卜素、花药黄素、α-类胡萝卜素、紫黄素等，普遍存在于动物、高等植物、真菌、藻类和细菌中。自从19世纪初分离出胡萝卜素以来，至今已经发现近700多种天然的类胡萝卜素，但是类胡萝卜素的机体作用机制至今未解释清楚，主要是因为其种类繁多，许多类胡萝卜素还存在多种异构体。近年来出现了很多关于类胡萝卜素的研究，如张春秋等从马铃薯中成功提取类胡萝卜素。还有一些研究人员以柿子皮、沙棘果、银杏叶、螺旋藻、海蟹等为原料提取类胡萝卜素。随着可利用食品新资源的不断丰富，提取出来的类胡萝卜素种类也相应增加，而其种类及其含量的准确分析测定就成为当代研究的一个重要内容。

1 类胡萝卜素检测前纯化技术研究进展

类胡萝卜素在分析检测之前一般要经浓缩或者干燥过程进行纯化，常用的方法有利用溶液极性不同进行梯度萃取分离法、薄层层析法等，虽然简便易行，但分离效果较差。近年随着科学技术的进步，出现了许多纯化速度更快、效果更好的方法，如柱层析法、膜分离法、液相色谱法等。

1.1 柱层析法

柱层析法是将固定相装在一金属或玻璃柱中，或是将固定相附着在毛细管内壁上做成色谱柱，试样从柱头到柱尾沿一个方向移动而进行分离的方法。胡晓丹等在提取金盏菊花中的类胡萝卜素过程中，采用氧化镁、氧化铝和层析硅胶三种玻璃层析柱，以石油醚浸润，类胡萝卜素粗提液通过层析柱后，将洗脱液用薄层色谱法评价三种填充料的纯化效果，数据显示氧化镁纯化效果最优。Cristiane H等应用活化的氧化镁/硅藻土（质量比1∶1） 填充柱纯化β-胡萝卜素、叶黄素、新黄素和紫黄质等几种类胡萝卜素，以便于高效液相色谱检测。柱层析法一般用于类胡萝卜素的粗提取，对单体颗粒以及直径大小要求不严格，目前此种方法在国内外应用比较广泛。

1.2 膜分离法

膜分离技术指在分子水平上，使不同粒径分子的混合物在通过半透膜时选择性分离，从而有效地实现溶液的浓缩，除去其他杂质。李媛媛在研究膜分离技术法纯化栀子黄色素影响因素时，采用陶瓷膜微滤对栀子黄色素萃取液原料进行不同压力及膜孔径条件下纯化实验，最终确定了陶瓷膜孔径200 nm，压力0.125 MPa是最佳的工艺参数。Ming Chih Chiu等曾利用平板高分子膜（NF10） 从粗制的棕榈油中精制类胡萝卜素，结果显示分离效率极佳，建议在色素精制乃至食品行业进行推广。

1.3 大孔吸附树脂法

大孔吸附树脂是依靠他和被吸附的分子之间的范德华引力，通过他巨大的比表面进行物理吸附而工作，使有机化合物根据吸附力及其分子量大小可以经一定溶剂洗脱分开而达到分离、纯化目的。陆伟等选择了几种不同的大孔树脂对提取的栀子黄色素进行精制，结果显示D3520和D140两种树脂精制效果较好。多种研究结果表明大孔吸附树脂法兼具操作简便，效率高等优点，可直接应用于工业生产。

1.4 凝胶层析法

凝胶过滤层析是利用具有网状结构的凝胶分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。吕晓玲等采用凝胶层析法对栀子黄色素进行精制，采用的支持剂为葡聚糖凝胶，进行了双柱串联层析，精制得率48.9%，得到的精制黄色素稳定性得到极大提高。此种方法对于高分子物质具有很好的分离效果，在未来的研究过程中可以逐步得以推广。

1.5 高速逆流色谱法

高速逆流色谱是一种液-液色谱分离技术，即利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，当其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量固定相，不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现。Hua Bin Li等应用体积比为5∶5∶6.5∶3的正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水溶剂体系成功地从虾青素绿球藻粗提物中得到纯度大于97 g/100 g的虾青素。Susanne Baldermann等采取体积比为30∶11∶18的正己烷、二氯甲烷、乙腈溶剂系统，在10℃、15℃、20℃和25℃四个温度条件下从番茄酱粗提物中分离出全反式番茄红素。此种方法可以避免因不可逆吸附而引起的样品损失、变性、失活等，不但可以全部回收样品，而且回收得到的样品更能反映其本来的特性。

2 类胡萝卜素分析检测技术

类胡萝卜素的分析检测方法以前常用包括纸层析法、薄层色谱法、紫外可见光分光光度计法等。利用这些方法只能进行简单的分析测定，却不能实现含量、结构的准确分析鉴定，因此近年来出现了许多新的快速准确的检测技术。

2.1 色度计法

亨特色度法由三个基本坐标表示颜色，亮度L*（L*=0生成黑色而L*=100指示白色），a*（负值指示绿色而正值指示品红），b*（负值指示蓝色而正值指示黄色）。色度计法主要是通过建立色度-含量曲线，再通过测得的色度结果推断类胡萝卜素的含量。此种方法广泛应用于测定蔬菜水果经热处理后颜色的变化，而且色度值与食品中的物质含量及种类有关。A.Bengtssona等将实验测得的参数结果α为横坐标，以β-类胡萝卜素含量为纵坐标，得到直线方程为y=25.4x－55.6（R=0.96），从而快速测定黄色果肉甘薯中β-胡萝卜素含量。利用此种方法进行含量测定方便快捷，主要是外国学者研究此类方法。

2.2 高效液相色谱法

高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成。N.M.Sachindra等采用C18柱子，流动相为体积浓度80%～100%的甲醇溶液，流速为2.0 mL/min，吸收波长为440 nm，结果显示在印度海洋生长的蟹中其虾青素及其酯类为主要的类胡萝卜素，而在淡水中生长的蟹玉米黄质占其类胡萝卜素的大部分。J.P.Chena等应用了一种改进的HPLC的方法，流动相为体积比99∶1的甲醇/异丙醇（A） 与二氯甲烷（B） 进行梯度流动分析，采用C30柱，检测波长为450 nm，进样流速1.0 mL/min，测定出来台湾芒果中至少存在25种类胡萝卜素。Verica Dragovic-Uzelac等利用此种法分析了三个品种的杏中的类胡萝卜素含量与成熟期及品种的关系，分析得到的类胡萝卜素主要为β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、α-胡萝卜素和叶黄素等。高效液相色谱法在国内外各种研究中应用非常普遍。

2.3 毛细管液相色谱法

毛细管液相色谱法与普通的液相色谱法的检测原理类似，即用毛细管柱代替了常规液相柱。这种分析方法可以节省样品的用量，因而减少了有机溶剂的消耗和对环境的污染。

Hui Xu等采用毛细管液相色谱法对固相微萃取技术提取的β-胡萝卜素进行测定分析，采用单片硅ODS柱，其中最优条件：样品量100 nL；检测波长452 nm；甲醇做流动相；流速1.0 μL/min。β-胡萝卜素检测限1.9 ng/mL，结果显示此方法的峰面积标准偏差小于5%。随着分析仪器向小型化发展的趋势，毛细管液相色谱将越来越多地被人们使用。

2.4 凝胶渗透色谱法

凝胶渗透色谱法是根据物质在分离柱上不同的分子流体力学体积大小进行分离测定。当仪器和实验条件确定后，溶质的淋出体积与其分子量呈反比关系。Dan Qiu等借助凝胶渗透色谱法，进行了固体β-胡萝卜素经加热后异构化产物及降解反应产物的鉴定，系统由Waters 1525 HPLC高压泵、Waters 2414 RI检测器、HR3-HR2-HR1色谱柱组成，采用洗提液为四氢呋喃，流速1.0 mL/min，通过得到的分子量与时间曲线进行结果分析。应用凝胶渗透色谱法可以有效的鉴定不同分子大小的类胡萝卜素。

2.5 质谱仪法

质谱仪法是一种利用电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或分子碎片）按他们的质荷比分离后进行检测的方法。Cristiane H等在测定菊苣和新西兰菠菜中类胡萝卜素受成熟度、季节及加工因素的影响时，采用质谱仪法进一步鉴定类胡萝卜素的分子量，电子轰击质谱Waters集成系统配置有HPLC-MS接口，雾化器温度为90℃，电离电压为70 eV，离子源温度为210℃，质核比为150～650，最后得到的鉴定结果显示，新叶黄素和紫黄质质荷比m/z为600，叶黄素分子量为568，β-胡萝卜素分子量为536，为更准确地鉴定物质提供了有利的数据。由于质谱分析具有灵敏度高，样品用量少，分析速度快，分离和鉴定同时进行等优点而被人们广泛采用。

2.6 红外光谱法

每种物质分子都具有由其组成和结构决定的独有的红外吸收光谱，用红外光谱法，可以根据光谱中吸收峰的位置、形状来推断被检测物质的结构，依照特征吸收峰的强度来测定混合物中各组分的含量。

Daniel E等在分析西红柿中类胡萝卜素含量时，借助FTS 3 500GX傅立叶变化红外光谱仪，操作分辨率为8 cm-1，吸收波谱通过高频区400 cm-1～7 000 cm-1确定，通过类胡萝卜素的化学结构，分析西红柿中的类胡萝卜素，从而确定西红柿的品种及产区，该方法快速简单，科学性强。Xinjuan Chen等利用近红外系统，采用的反射光谱（log 1/R） 为1 100 nm～2 500 nm，以2 nm为间隔，检测了151个中国羽衣甘蓝样品中的叶黄素和β-胡萝卜素。这种方法与HPLC法相比更加精确，同时此法具有快速、高灵敏度、检测试样用量少等优点，将来必然会应用到类胡萝卜素的更多检测工作中。

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Arecent survey research on purification and analysis ofcarotenoids

ZHANGXiao-ming1*JIAYan-qin2XUChun-chao2Mou De-hua1**
1(College ofbiologyscience and engineering，Hebei universityofscience and technology，Shijiazhuang 050018，China)
2(Hebei province dingxingcountyqualityand technical supervision&testinginstitute，Dingxingxian 072650，China)

Carotenoids comprise a class of natural pigments.With the rapid development of analysis methods，more and more carotenoids were found.The high-performance ion chromatography （HPIC），Mass Spectrometry（MS），membrane separation and High-speed Countercurrent Chromatography （HSCCC）were summarized.These enabled further investigation of Structure and Properties ofcarotenoids.

carotenoids；purification；analysis method

*张小明，男，1986年出生，河北科技大学在读硕士研究生。

**通讯作者：牟德华，男，教授，主要从事农产品深加工以及天然产物分离的研究。Email:dh-mou@163.com.

2010-09-25