梁宝爱 张素娟

（国家农副加工产品及白酒质量监督检验中心、山西省食品质量检验监督中心，太原 030012）

水产品及水产制品中三聚氰胺检测方法的研究

梁宝爱*张素娟

（国家农副加工产品及白酒质量监督检验中心、山西省食品质量检验监督中心，太原 030012）

采用气相色谱-质谱/质谱法（GCMS/MS） 对鲜、冷或冻水产品（养殖鱼、虾、蟹、贝等） 及水产制品（干、熏、盐制水产） 中三聚氰胺进行了检测。样品采用乙睛和甲醇提取，提取液离心净化，氮气吹干，利用衍生化试剂BSTFA-TMCS（体积比为 99∶1） 进行衍生化反应、优化仪器条件、考察基体干扰，利用三重四级杆气相色谱联用的多反应监测（MRM） 技术，对三聚氰胺衍生物进行定性定量分析。以三聚氰胺衍生物离子对m/z 342＞171、m/z 342＞327离子对进行定性，以m/z 342＞327进行定量。方法的线性范围为 0.005 μg/L ～ 0.1 μg/L；回归方程为y=1 434 164.378 8x-704.012 5，相关系数R2=0.999 4；方法定量限0.03 mg/kg。回收率达90%以上，相对标准偏差RSD＜5.0%。该方法简便、快速、灵敏、准确，适合于水产品和水产制品中三聚氰胺含量的确证和定量测定。

水产品及水产制品；三聚氰胺；检测；气相色谱—质谱/质谱法

食品安全直接危害人民群众身体健康和生命安全，危及企业生存，甚至影响我国产品声誉、国际贸易和国家形象。乳制品中三聚氰胺事件的出现，企业缺乏自律是根本，但缺乏检测方法和手段，以至于无法查处这些违法添加物也是重要的原因之一。2008年10月，香港市场上从内地进口的鸡蛋中检测出三聚氰胺，香港对内地进口鸡蛋开始全面检测，并将检测范围扩大至从内地进口的肉类及动物内脏。因此，尽快开发出相应的检测方法，对其他动物源性食品中三聚氰胺的检测和监控具有很重要的意义。

1 实验方法

1.1 主要试剂

甲醇、乙腈、三氯甲烷，均为色谱纯；吡啶，分析纯；衍生化试剂，N，O－双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA） +三甲基硅烷（TMCS），体积比为99∶1；三聚氰胺标准物质（C3H6N6），纯度≥99.0 g/100 g。

1.2 主要仪器

Agilent 7100气相色谱-质谱 /质谱（GC-MS/MS）仪：配有电子轰击电离离子源（EI）；分析天平，感量0.01 g和0.000 1 g；高速万能粉碎机；涡旋混合器；匀浆机；超声波水浴；高速冷冻离心机，转速不低于4 000 r/min；氮气吹干仪；电热恒温干燥箱；具塞塑料离心管。

1.3 试样前处理

1.3.1 水产制品

准确称取粉碎混匀的试样1 g（精确到0.01 g），加入10.00 mL乙腈水或甲醇水，涡旋混匀2 min后超声提取20 min，于4℃以不低于4 000 r/min离心10 min，取上清液用直径0.2 μm微孔滤膜过滤，准确吸取200 μL滤液，50℃下氮气吹干，衍生化后待测。

1.3.2 水产品

准确称取混匀试样1 g（精确到0.01 g，试样取可食部分切碎混匀），加入10.0 mL乙腈或甲醇，涡旋混匀2 min后超声提取20 min，于4℃以不低于4 000 r/min离心10 min，取上清液用直径0.2 μm微孔滤膜过滤，准确吸取200 μL滤液，50℃下氮气吹干，衍生化后待测。

1.3.3 衍生化

取上述氮气吹干残留物，加入600 μL吡啶和200 μL衍生化试剂，混匀，70℃反应30 min，供GC-MS/MS法定量检测或确证。

1.4 质谱条件

1.4.1 仪器参考条件

a)色谱柱：5%苯基二甲基聚硅氧烷石英毛细管柱，30 m×0.25 mm（i.d.）×0.25 μm，或相当者；

b) 流速：1.0 mL/min；

c) 程序升温：75℃保持1 min，以30℃/min速率升温至220℃，再以5℃/min速率升温至250℃，保持2 min；

d）进样口温度：250℃；

e） 接口温度：280℃；

f）进样量：1 μL；

g）进样方式：不分流方式，溶剂延迟4.5 min；

h）电离方式：电子轰击电离（EI）；

i）电离能量：70 eV；

j）离子源温度：230℃；

k）四级杆温度：150℃；

l）碰撞气流速：高纯氮气1.5 mL/min；

m）碰撞能量：10 eV；

n） 扫描方式：采用多反应检测（MRM），定量离子m/z342＞327，定性离子m/z342＞327，342＞171。

1.5 测定

1.5.1 标准曲线的绘制

准确吸取三聚氰胺标准溶液（10μg/mL），0mL、0.04 mL、0.08 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL分别于7个100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。各取1 mL用氮气吹干，按1.3.3步骤衍生化。配制成衍生产物质量浓度为0.0μg/mL、0.005μg/mL、0.01μg/mL、0.025μg/mL、0.05μg/mL、0.075μg/mL、0.1 μg/mL的标准溶液。反应液供GC-MS/MS测定。以标准工作溶液质量浓度为横坐标，定量离子质量色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。

1.5.2 定量测定

待测样液中三聚氰胺标准的响应值在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应对净化液稀释，重新衍生化后再进样分析。

1.5.3 定性判定

以标准样品的保留时间以及多反应检测离子（m/z 342＞327、342＞171） 定性；样品中目标化合物的两个离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表1的规定，则可判断样品中存在三聚氰胺。

表1 定性离子相对丰度的最大允许偏差

1.6 结果计算

试样中三聚氰胺的含量由色谱数据处理软件或

式中：X—试样中三聚氰胺的含量，mg/kg；

A—试样中三聚氰胺的峰面积；

c—标准溶液中三聚氰胺的质量浓度，μg/mL；

V—样液最终定容体积，mL；

As—标准溶液中三聚氰胺的峰面积；

m—试样的质量，g；

f—稀释倍数。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的选择

由于气相-质谱/质谱法具有分析速度快、检测灵敏度高和应用范围广泛的特点，本试验选用了气相-质谱/质谱仪器，仪器条件选择主要参照了GB/T22388-2008《乳及乳制品中三聚氰胺的检测方法》中气相-质谱/质谱法（GC-MS/MS） 的仪器条件，结合实验仪器的特点调整了碰撞能量、碰撞气流速、接口温度。

2.2 样品前处理方法的选择

三聚氰胺具有溶于热水，微溶于冷水，极微溶于热乙醇，不溶于醚、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等特性；结合乳制品中三聚氰胺提取和净化的前处理方法，优化本课题中5类产品中三聚氰胺的提取和净化方法，选择了乙腈或甲醇超声提取（动物油脂需先使用三氯甲烷溶解，再用甲醇超声提取），提取液离心过滤净化。

2.2.1 水产制品

准确称取混匀试样1 g（精确到0.01 g），加入10.00 mL乙腈水或甲醇水，涡旋混匀2 min后超声提取20 min，于4℃以不低于4 000 r/min离心10 min，取上清液用直径0.2 μm微孔滤膜过滤，准确吸取200 μL滤液，50℃下氮气吹干，衍生化后供GC-MS/MS法定量检测或确证。对虾米、熏鱼片、盐制鱼等水产制品中三聚氰胺进行了加标检测，回收率达90%以上，反复实验，RSD＜5.0%。

2.2.2 水产品

准确称取混匀试样1 g（精确到0.01 g，试样取可食部分切碎混匀），加入10.0 mL乙腈或甲醇，涡旋混匀2min后超声提取15min，于4℃以4000r/min离心10 min，取上清液200 μL用直径0.2 μm有机滤膜过滤，氮气吹干，衍生化后供GC-MS/MS法定量检测或确证。对鲜鱼、冻虾、鲜蟹、鲜贝等水产品中三聚氰胺进行了加标检测，回收率达90%以上，反复实验，RSD＜5.0%。

2.2.3 衍生化

取上述氮气吹干残留物，加入600 μL吡啶和200 μL衍生化试剂混匀，70℃反应30 min，供GC-MS/MS法定量检测或确证。

2.3 线性范围的确定

确定标准系列的范围，选用从0.005 μg/mL至0.1 μg/mL，6个不同质量浓度的三聚氰胺标准溶液进行实验，结果从标准系列来看，线性关系良好，R2=0.999 4。见图1、图2、图3。

图1 三聚氰胺标准曲线图

图2 三聚氰胺衍生物GC-MS/MS选择离子质谱图

图3 三聚氰胺衍生物GC-MS/MS多反应监测质量质谱图

2.4 检出限的确定

在本试验条件下，将标准溶液连续稀释后进行干虾米、烤鱼片、鲜鱼、鲜虾、鲜蟹、鲜贝、空白样品的加标回收，根据3倍噪音的峰响应值和10倍噪音的峰响应值、取样量和进样量，得出该方法检出限为0.01 mg/kg，该方法定量限为0.03 mg/kg。

2.5 精密度的测定

对虾米、熏鱼片、鲜鱼、冻虾、鲜蟹、鲜贝等样品前处理采用了乙腈超声提取法和甲醇超声提取法两种方法，分别按已确定的仪器方法对三聚氰胺进行6次测定（对不同样品加不同质量浓度的三聚氰胺标准溶液），相对标准偏差RSD＜5.0%。

2.6 回收率的测定

取虾米、熏鱼片、盐制鱼、鲜鱼、冻虾、鲜蟹、鲜贝等样品使用乙腈超声提取和甲醇超声提取，分别离心净化，氮气吹干，衍生化后按已确定的质谱条件加不同质量浓度的三聚氰胺标准溶液进行测定，回收率均＞90.0%。

3 结语

通过大量试验证明，用上述方法可以对水产品及水产制品食品中三聚氰胺进行准确的定性和定量测定，标准曲线线性相关系数R2＝0.999 4，线性关系良好；方法回收率达90%以上；RSD＜5.0%，精密度高。

［1］宋书锋，鲁杰，安娟，等.GB/T22388-2008原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法〔S〕.中国国家标准出版社，2008.

［2］李红梅，张庆合，汤桦，等.GB/T 22400-2008原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法〔S〕.中国国家标准出版社，2008.

Research on the detection methods of melamine content in fishery products and aquatic products

LIANGBao-ai*ZHANGSu-juan
（National farmproducts and liquor qualitysupervision and inspection center,Shanxi Province foodstuffqualitysupervision and inspection center，Taiyuan 030012，China）

The melamine contents in fresh,cool or frozen fishery products（farming-fish,shrimp,crab,cowry and so on）and aquatic products(dried,smoke-dried,saline)were detected by gas chromatography-mass/mass spectrometry (GC-MS/MS).Samples were extracted with acetonitrile and methanol，extracting solution was purged after decentralization，blowed dry through nitrogen and derivatized with a mixed system composed of BSTFA and TMCS （99:1，V/V）prior to GC-QqQ-MS/MS analysis in multiple reaction monitoring（MRM）mode.The optimal values of crucial instrument parameters and matrixinterference were investigated.Melamine was qualified using the ion pairs of m/z 345＞171 and m/z 342＞327 and quantified using the ion pair of m/z 342＞327.The developed method exhibited good linearitywithin the range of0.0050 to0.100 ug/L.The regression equation was y=1 434 164.378 8x-704.012 5，and correlation was 0.999 4.The detection Limit was 0.03 mg/kg for melamine(RSN=10)and the recoveries for determining melamine were greater than 90%.The relative standard deviations were less than 5.0%.This method is simple and convenient,rapid,sensitive and accurate，and can meet analysis requirements ofmelamine in fisheryProducts and aquatic products.

fishery products and aquatic products；melamine； detection； gas chromatography-mass/mass spectrometrymethod

*梁宝爱，女，1963年出生，1983年毕业于太原理工大学化学分析专业，高级工程师。

2010-11-04