王秀宏

(天津市中医药研究院附属医院,天津 武清 301700）

微小RNA（miRNA或miR）是近几年发现的一类长度约22个核苷酸的内源性非编码RNA，通过与靶mRNA互补结合，在转录后水平调节靶基因的表达是细胞内基因表达的调控机制之一。迄今为止，已在哺乳动物细胞中鉴定出800多种miRNA，它们在细胞生长、分化、增殖、凋亡及体内稳态等多种生理过程中发挥重要调节作用［1-2］。miRNA的异常表达与各种类型恶性肿瘤（包括血液源性恶性肿瘤）的发生密切相关，在不同类型肿瘤有特征性的表达。大约50%的miRNA定位于基因组与肿瘤相关的脆性位点（FRA）上，这些miRNA所起的作用类似于抑癌基因和癌基因[3]。深入理解miRNA在肿瘤中的作用，对其早期诊断及建立有效的miRNA靶向治疗具有重要意义。

1 miRNA的生成及作用机制

目前人类miRNA的生物合成已得到较为详尽的阐述。首先，在细胞核中，miRNA基因由RNA聚合酶II或聚合酶［3］转录成较长的（100～1000个核苷酸）含有5’7-甲基鸟苷帽子及3’polyA尾的初级转录物（Pri-miRNA）；而后，Pri-miRNA被RNaseIII型核酸内切酶Drosha及其辅酶DGCR8加工成约70个核苷酸的茎环发卡结构前体（Pre-miRNA），随后由GTP依赖的转运蛋白Exportin-5运至细胞质之中。细胞质中的前体被另一种RNaseIII型核酸内切酶Dicer及其辅助因子TRBP/PACT剪切掉环状结构，形成约22个核苷酸的双链miRNA［4］。其中的一条链在Argonautes蛋白引导下进入RNA诱导的沉默复合体（RISC），成为成熟miRNA，同时另一条链降解。

成熟miRNA通过与特异的靶mRNA3’UTR（3’非翻译区）核酸序列互补结合，对靶基因产生调控。其作用方式有两种：靶向降解mRNA和抑制靶mRNA翻译，到底产生哪种作用主要取决于miRNA与靶mRNA互补作用［5］。前者是靶向特异的miRNA分子与胞质中的核酸内外切酶、解旋酶等一起构成RISC，对靶mRNA进行切割，发挥基因沉默效应，该机制要求miRNA与靶mRNA严格互补；而抑制翻译机制，则是miRNA序列与mRNA3’UTR序列结合，抑制核糖体功能，从而抑制相应mRNA的翻译过程［5］，该机制不需要严格互补，只要miRNA序列与靶向mRNA3’UTR序列部分互补结合，就可发挥作用，这种方式不影响靶mRNA的稳定性，只影响蛋白表达水平。该机制的存在使一个miRNA可以调节多个靶基因，而一个靶基因也可受多种miRNA的调节，使得调节机制更加复杂。在与靶基因识别过程中，miRNA5’端2～8个核苷酸几乎无一例外地能与靶mRNA3’UTR完全互补，在特异识别靶mRNA中起关键作用，被称为“种子序列”。虽然绝大部分研究集中于miRNA介导的基因沉默，但Vasudevan等［6］的研究显示miRNA也可以促进翻译过程。他们发现，在饥饿诱导的细胞周期G1捕获期间，miR369-3和人工合成的miRNA模拟CXCR可以增强mRNA翻译，而在其他细胞周期抑制翻译。这一研究无疑拓宽了miRNA对蛋白表达的作用，而且也增加了miRNA应用的复杂性。有研究显示miRNA还可去掉mRNA的poly-A尾从而加速靶向mRNA的降解，不需要二者碱基的严格配对［7］，并有可能产生“旁观者效应”，加速其他mRNA的降解。

2 miRNA参与肿瘤病理过程的机制

2.1 激活癌基因或沉默抑癌基因 miRNA-221/222在多种恶性肿瘤中高表达。研究发现，在前列腺癌中miRNA-221以肿瘤抑制因子P27基因为靶点，转录后沉默其mRNA翻译过程，下调其功能表达［8］。P27是肿瘤抑制因子，在肿瘤中的表达通常被破坏，其缺失可增加肿瘤的发生率和增长率。P27的表达水平下降与肿瘤进展及肿瘤患者的不良预后呈正相关［9］。P16基因抑制周期素依赖性蛋白激酶4活性，维持PRB基因的低磷酸化，而使细胞分裂停留在G1期，在肿瘤组织中P16呈普遍的低表达状态。报道显示，在宫颈癌细胞株中miRNA-24与P16表达水平呈负相关，失活miRNA-24的表达可增加P16基因表达水平，并且miRNA-24的5’端“seed sequence”序列与P16 mRNA的3′端UTR区互补，认为miRNA-24下调P16水平而诱导肿瘤发生［10］。

2.2 调控凋亡基因 miRNA-15a/16-1可通过干扰BCL-2 mRNA增加肿瘤细胞凋亡活性，引起肿瘤细胞死亡。Lu Z等也发现，在乳腺癌细胞株MCF-7中，miRNA-21表达升高并可通过沉默程序化细胞死亡4基因的mRNA促进细胞增殖［11］。Wang等研究证实，携带致瘤基因HPV的宫颈癌组织和Caski，SiHa，HeLa，C411，ME180细胞株中显示肿瘤抑制基因miR-34a的表达减少。在器官组织中miR-34a表达的减少源于包含HPV的人类角质化细胞的早期生产阶段中病毒E6蛋白的表达，E6的表达影响肿瘤抑制因子P53（一种miR-34a的转录因子）。在HPV16（+）和HPV18（+）子宫颈癌细胞系中，E6的表达导致P53和miR-34a表达的增加。在HPV（+）Hela细胞和HPV（-）HCT116细胞中，miR-34a的异常表达导致细胞发育迟缓和适度的细胞凋亡。这是首次证明一种病毒致瘤蛋白能调节细胞miRNA的表达［12］。

2.3 细胞黏附 E-钙黏蛋白主要在乳腺癌中被广泛研究，有报道miRNA-9可通过调节E-钙黏蛋白表达影响乳腺癌细胞的侵蚀转移能力［13］。

2.4 诱导血管生成 一些miRNA分子可通过调节血管内皮细胞生长因子、环氧化酶2等改变肿瘤细胞的血管生长能力［14］。

2.5 增强肿瘤细胞侵蚀能力 miRNAs除了在促使原始肿瘤的发生过程中起作用外，同时还在肿瘤的进展包括致命性的肿瘤转移中起重要作用。肿瘤细胞的浸润是肿瘤转移的前提，而上皮细胞-间质转化（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）在浸润过程中起重要作用。细胞转移生长因子（TGF-β）、转录因子Snail、基质金属蛋白酶（MMPs）及病毒癌基因可以诱导EMT；肿瘤细胞EMT与肿瘤细胞的浸润、转移、信号转导都有关系。研究肿瘤细胞EMT将为寻找抗肿瘤治疗新靶点奠定基础。

Tavazoie等微阵列芯片筛选了多个具有高度转移特性的乳腺癌MDA-MB-231衍生细胞株，发现一系列miRNA的异常表达与乳腺癌的远处转移密切相关。其中mir-335和mir-126对抑制肿瘤转移发挥着关键性作用；这两种miRNA表达缺失的乳腺癌患者生存率低。该试验表明miRNAs在乳腺癌的发生发展中起着重要的作用［15］。

miR-10b是Twist 1基因的直接转录靶点，而Twist 1是诱导EMT和肿瘤转移进展的一个基因。在非转移性乳腺癌细胞株中其异常表达miR-10b可促进细胞入侵和转移，这部分是由于直接抑制同源蛋白HOXD10的表达而导致的。

3 miRNA在肿瘤诊断中的作用

迄今为止，已有多个研究证实miRNA在不同类型的肿瘤中表达不同，可应用于肿瘤的诊断及分型。Lu Z等检测了334个样本中217种miRNA表达，样本包括多种肿瘤组织及正常组织，发现在不同肿瘤中miRNA表达不同；通过miRNA表达特征可进一步区分肿瘤的分子血亚型，如bcr-abl阳性样本；另外，在组织学无法准确诊断的17种恶性肿瘤中，通过miRNA筛选可区分该类肿瘤，较mRNA表达谱芯片更为准确。

Ng E K等就血浆中95种miRNA表达水平与结直肠癌的发生进行了比较系统地探讨。研究者采用实时定量RT-PCR的方法分别检测了结直肠癌患者和健康人血浆中的95种miRNA的表达情况，发现miR-92在结直肠癌患者血浆中的表达水平显著增高，有趣的是，并没有检测到miR-92在晚期结直肠癌患者血浆中过度性表达，提示血浆miR-92可以作为早期结直肠癌的诊断性标志物［16］。

miRNA的检测常用的方法包括RNA印迹分析方法、miRNA基因芯片（microarray）和实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）等。RNA印迹分析方法是研究miRNA表达水平最可靠的技术，常用于检测肿瘤细胞中miRNA的表达水平，但该技术有操作复杂、费力、费时的缺点。miRNA基因芯片技术是一种更理想的检测miRNA的表达图谱的方法，能同时检测多个miRNA，但miRNA基因芯片技术只能分析已知的miRNA表达水平，不能分析未知的miRNA。实时定量RT-PCR是实用价值很高的定性定量检测技术，具有用时少、灵敏度高、精确度高、重复性好、可以高通量检测、能有效区分miRNA前体分子以及其他成熟miRNA同源分子等优点，已被越来越多地应用于miRNA的检测。

最近的研究取得了一定的进展，我们了解到外周血中的miRNA很可能来源于机体多种组织及多种类型的细胞，包装于外染色体（exosome）或经过转录后修饰释放入血，从而免受RNase的降解［17-20］。Valadi等表示某些mRNA、miRNA选择性地包装于外染色体，似乎mRNA、miRNA有着自己的“命运”，这或许是不同来源的标本（组织、血清、血浆、全血等）含有不同种类miRNA的原因之一。

对miRNA在肿瘤中的表达特征、miRNA靶基因的证实，miRNA抑癌、致癌机制及其表达失调机制的研究，对于肿瘤的临床诊断、治疗和预后具有重要意义。miRNA将影响着肿瘤治疗的新进展已为期不远。

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