张晓东，刘怀然，刘培欣，刘胜旺，孔宪刚

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室，黑龙江哈尔滨150001)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由 ND病毒(NDV)引起的一种以呼吸道、消化道黏膜出血为典型症状的，严重危害养禽业的急性高度接触性传染病。ND目前在世界范围内许多国家都有流行，对养禽业造成极大的威胁[1]。NDV为副粘病毒科、副粘病毒亚科、禽腮腺炎病毒属成员[2]。根据各病毒株对鸡的致病性存在较大差异。弱毒株被用作为疫苗株防制ND。其中La Sota株是应用最广泛的一株。

无论是基础研究还是应用研究，首先都需要对新城疫病毒进行纯化。然而与ND强毒株相比，弱毒株较难在鸡胚成纤维细胞上(CEF)进行蚀斑纯化。因此，在蚀斑方法的基础上[3-4]，我们设计了另一种称为cytopathogen assay的方法，对La Sota株NDV进行纯化，该方法的独特之处是挑取细胞的病变区，从而获得了3个病毒克隆株Clone 1、Clone 4、Clone 22。通常一个病毒克隆株来源于一个病毒粒子，所以该病毒克隆株的性质是高度均一的。本研究中，通过血凝素热稳定性试验，病毒复制动力学试验和免疫原性试验，对3个克隆株进行了比较分析。结果显示，各个克隆株间在3种主要的生物学特性方面存在着不同程度的差异。

1 材料和方法

1.1 病毒株及SPF鸡胚 NDV La Sota株由本研究室保存；SPF鸡胚由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。CEF通过胰酶消化10日龄SPF鸡胚制备。

1.2 主要试剂 DMEM培养基购自GIBCO公司；ExTaq、PrimeSTAR HS DNA Polymerase购自宝生物工程(大连)有限公司；M-MuLV购自MBI公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司。

1.3 Cytopathogen assay 该方法是挑取的细胞病变区。将挑取的含有感染细胞的一小块琼脂放入盛有1 mL培养液的2 mL冻存管中。

1.4 3个病毒克隆株的F基因鉴定与序列分析 经过3次反复冻融后，将含有病毒的培养液接种到10日龄SPF鸡胚的尿囊腔中。37℃孵育5 d后，收取尿囊液并测定血凝活性。用TRIzol提取总RNA，以上游引物P1进行反转录，再用P1/P2扩增含F基因47 nt～420 nt的核苷酸片段,PCR扩增产物由上海生工进行序列测定。上游P1(4358～4377)：5'-GCC ATTGCTAAATACAATCC-3'；下游P2(5217～5197)： 5'-GGCCCGAATACTGTAGTCAAT-3'。 使 用MegAlign(DNAStar)中的Clustal W方法进行3个病毒克隆株序列的同源性分析。

1.5 血凝素热稳定性试验 参考文献[5]和[6]的方法进行。简而言之，将上述含病毒的尿囊液以100 r/min离心10 min,取上清液0.5 mL分装于小管中，分别置56℃水浴2 min、4 min、6 min、9 min、11 min后立即冷却,测定经过处理后的HA活性。不凝集者证明血凝素消失。

1.6 病毒的复制动力学研究 按4.0 log EID50/枚的剂量接种10日龄SPF鸡胚尿囊腔。在接种后24 h、48 h、72 h及96 h取样，每个时间点随机抽取6枚胚，收集尿囊液，混匀后分别测定其EID50。

1.7 病毒克隆株的免疫原性评估 40只SPF鸡平均分配饲养于4个负压隔离器中。以106EID50/0.1 mL剂量将Clone 1、Clone 4、Clone 223个病毒克隆株经滴鼻、点眼的途径分别接种10只SPF鸡。并设有一个对照组，仅接种0.1 mL的PBS。免疫后5 d、10 d、13 d、19 d、28 d、36 d和49 d翅静脉采血分离血清，按文献[7]方法检测NDV特异性HI抗体。

1.8 统计学分析 使用SPSS Version 11.5.0进行统计分析。使用卡方检验血凝素热稳定性的结果；方差分析病毒复制动力学和抗体滴度的结果，具体采用One-way ANOVA分析。

2 结果

2.1 核酸序列比对分析和血凝素热稳定性试验结果 3个病毒克隆株在所扩增区域内的同源性为100%；其血凝素热稳定性均小于11 min(表1)。表明3个克隆均不耐热。然而，经方差分析发现，Clone 22的热稳定性要显著高于其它两组(p<0.05)。而Clone 1和Clone 4之间没有显著的差异(p>0.05)。

表1 3个克隆株病毒的血凝素热稳定性比较Table 1 Comparison of hemagglutinin thermostability of three virus clones(cytopathogen 1,4,22)

2.2 3个克隆株病毒在鸡胚内的复制动力学比较3个克隆株病毒的生长特性见图1。病毒的生长滴度都在接种后72 h达到峰值，随着培养时间的增加，均有略微的下降。Clone 1，4和22的最高生长滴度分别为9.71 log EID50/mL，9.88 log EID50/mL和9.71 log EID50/mL。经SPSS统计分析处理后，3者在鸡胚内的生长特性无显著差异(p>0.05)。

2.3 3个病毒克隆株在SPF鸡体内诱导抗体能力的差异分析 在大部分的时间内，3个克隆株病毒诱导的抗体滴度没有显著差异(表2)。除了免疫后的第49 d，Clone 1和Clone 4在整个监测期间内诱导抗体产生能力无显著差异。Clone 22诱导的抗体滴度在免疫后第28 d达到峰值，与Clone 1和Clone 4相比推迟了15 d。免疫后的第5 d、13 d、49 d，3个病毒克隆株间存在着显著的差异。但是，Clone 4却始终保持着相对较高的滴度。这些结果表明Clone 4诱导的抗体出现的较早且消失的较慢。

表2 3个病毒克隆株诱导的抗体滴度Table 2 Antibody titers to La Sota strain of NDV as determined by HI assay

3 讨论

Cytopathogen assay和Plaque assay是非常相似的两种试验方法，只是挑取的对象不同而已。鉴于新城疫弱毒株在CEF上较难形成蚀斑，却能出现明显的细胞病变，cytopathogen assay更适合这类病毒的纯化。F基因47 nt～435 nt是重要的功能域，常被用作分型的分子依据[8]。3者的同源性为100%也恰恰证明了cytopathogen assay的可靠性，同时也表明本研究所用La Sota株F蛋白裂解位点处核苷酸序列完全符合NDV弱毒株的序列特征。鉴于NDV具有RNA病毒的准种特性[9]，所以在3株病毒克隆株的全基因组上可能存在着一定的差异，这些差异和其生物学特性的关系值得进一步研究。

血凝素热稳定性试验显示，与另两个病毒克隆株相比，Clone 22有着显著较高的热稳定性。然而，毕竟它们的热稳定性均<11 min，所以也都属于热敏感型。但当我们使用4000 r/min和8000 r/min离心10 min时，4000 r/min离心获得的结果与100 g离心的结果非常相似。然而，8000 r/min离心时，热稳定性结果显示，3者间的差异则很小。这表明Clone 22的尿囊液中可能存在某种物质有助于Clone 22株耐热性的提高。同时表明La Sota株的这个生物学特性非常稳定，如果不经过特殊处理筛选，是不会轻易改变的。

本研究中，3个病毒克隆在鸡胚内的复制动力学没有显著的差异。然而，有一点值得注意，如果病毒在鸡胚中继续传代，放大效应就会产生，所以种毒在多次传代后，应定期进行检测，以便挑选生长特性较好的病毒克隆株。免疫原性分析结果显示3个克隆病毒在这个生物学特性上存在着一定的差异。免疫后5 d，Clone 22诱导的抗体滴度显著低于Clone 4；免疫后13 d，Clone 22的抗体滴度显著低于Clone 1和Clone 4；免疫后49 d，Clone 1的抗体滴度显著低于Clone 4和Clone 22的(p<0.05)。然而在大多数时间内，3个克隆病毒所诱导的抗体滴度并不存在显著差异。

本研究结果提示虽然克隆株都源自于同一个毒株，却来自于不同的亲本病毒粒子，所以不同的克隆之间在生物学特性方面会存在着微弱甚至可能显著的差异。尽管绝大多数的病毒克隆之间不存在显著的差异，而个别克隆株的某种生物学特性上与绝大多数克隆株间却会存在着显著的差异，毕竟NDV具有准种的特性。本研究还表明，如果实验采用的是野毒或新分离到的病毒，为获得性质均一、稳定的病毒，纯化工作是非常必要的。

[1]Alexander D J.A laboratory manual for the isolation and identification of avian pathogens[M].4th ed.Kennett Square:American Association of Avian Pathologists,1998,156-163.

[2]Mayo M A.A summary of taxonomic changes recently approved by ICTV[J].Arch Virol,2002,147:1655-1656.

[3]d'Herelle F.The Bacteriophage and Its Behavior[M].Baltimore:Williams＆Wilkins,1926.

[4]Dulbecco R,Vogt M.Some problems of animal virology as studied by the plaque technique[C].Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology,1953,18:273-279.

[5]Hanson R P,Spalatin J.Thermostability of the hemagglutinatinin of Newcastle disease virus as a strain marker in epizootologic studies[J].Avian Dis,1978,22:659-665.

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[7]Office International des Epizooties.OIE manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals[M].5th ed.Paris,France:Office International des Epizooties,2004.

[8]Lomniczi B,Wehmann E,Herczeg J,et al.Newcastle disease outbreaks in recent years in Western Europe were caused by an old(VI)and a novel genotype(VII)[J].Arch Virol,1998,113:49-64.

[9]Drake J W,Holland J J.Mutation rates among RNA viruses[J].PNAS USA,1999,96:13910-13913.