王 琪，葛金英，焦利红，曹有才，李晓艳，马 良，马吉飞，王笑梅，步志高*

(1.天津农学院动物科学系，天津300384；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨 150001)

传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)和新城疫(Newcastle disease，ND)为分别由IBD病毒(IBDV)和ND病毒(NDV)引起的禽类2种重大疫病。自上世纪80年代以来，欧洲及我国相继出现IBDV超强毒株(very virulent IBDV，vvIBDV)的流行[1]，该病能够引起鸡免疫机能障碍，对其他疾病的易感性增加；ND也给养禽业造成重大经济损失。因此，预防和控制这两种烈性传染病对养禽业的发展具有重要意义。

NDV作为一种活病毒载体具有独特优势：可同时诱导全身性体液免疫、局部粘膜免疫以及细胞免疫；可通过饮水、喷雾、滴鼻、点眼或肌肉注射等途径免疫；La Sota疫苗株长期用于家禽防疫，其安全性已被充分证明。Ge等利用反向遗传技术，构建表达H5N1禽流感HA基因重组NDV疫苗已经上市，该疫苗显示NDV具有作为活病毒载体疫苗应用的潜力[2]。

鸡胚免疫接种(Chicken embryo immunization)是指对一定胚龄的鸡胚接种疫苗，使得雏鸡出壳时至出壳后几天内具有特异性主动免疫力，该方法能够有效降低生产成本，具有产生免疫早、应激反应低、污染少等优点[3-4]。研究表明通过胚胎免疫来预防ND[5]和IBD[6]是安全有效的。

本研究选用表达vvIBDV VP2基因的重组NDV(rL-VP2)，用不同剂量对18胚龄SPF鸡胚进行免疫，确定该疫苗用于胚胎免疫的最佳免疫剂量，并对免疫后的安全性和有效性进行评估，为该重组二联活载体疫苗的应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 病毒株、鸡胚和雏鸡 rL-VP2疫苗株由哈尔滨兽医研究所人畜共患病研究室研制并保存；NDV强毒F48E9株和vvIBDV Gx株由哈尔滨兽医研究所菌毒种保藏中心提供；NDV抗原由本实验室保存；9胚龄和18胚龄SPF鸡胚、1日龄和6周龄SPF鸡雏均由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

1.2 主要试剂及仪器 IBDV抗体检测试剂盒购自IDEXX公司；胚胎免疫针头购自Tyco/Healthcare公司；孵化器和负压隔离器为Nature Form公司产品。

1.3 rL-VP2半数鸡胚感染量(EID50)和平均鸡胚致死时间(MDT)测定 将rL-VP2做适当稀释，按OIE推荐方法接种鸡胚，重复4次。按Reed-Muench法计算EID50；计算平均致死时间，按以下时间标准判定毒力强弱：速发型(急性，强毒)MDT≤60 h，中发型(亚急性，中等毒力)MDT为61 h～90 h，缓发型(低毒力)MDT>90 h。

1.4 rL-VP2脑内接种指数(ICPI)和静脉内致病指数(IVPI)测定 测定方法参照OIE标准进行。

1.5 试验分组及鸡胚免疫接种 将18胚龄健康SPF鸡胚随机分为8组，每组35枚。1组～7组接种rL-VP2，剂量分别为106EID50/枚、105EID50/枚、104.7EID50/枚、104EID50/枚、103.7EID50/枚、103EID50/枚和102EID50/枚，第8组接种等量无菌PBS。在相同的条件下孵化，出壳后，将各组鸡雏隔离饲养。出壳后第9 d、第14 d和第21 d由各组中随机选取10只雏鸡经翼静脉采血，检测抗NDV抗体和抗IBDV抗体水平。

1.6 血清中抗NDV抗体和抗IBDV抗体测定 采用微量凝集法[7]测定血清中抗NDV抗体HI滴度；按IDEXX公司IBDV抗体ELISA检测试剂盒说明书进行血清中抗IBDV抗体的检测。

1.7 攻毒试验 出雏28 d后，选择免疫后出雏率、存活率及抗体水平较理想的第4组的20只雏鸡，随机分为2组，其中，一组用NDV强毒F48E9株以105EID50/只剂量经肌肉注射途径攻毒，同时选取PBS接种组雏鸡10只，以相同的剂量和途径攻毒作为对照，观察2周，统计发病率和死亡率；另一组用vvIBDV Gx株以105EID50/只的剂量经滴鼻、点眼途径攻毒，随机选取10只经PBS接种的雏鸡，以相同的剂量和免疫途径攻毒，观察8 d后，对存活鸡进行剖检，测定法氏囊囊指数(BBIX)。

2 结果

2.1 rL-VP2致病性试验结果 rL-VP2EID50为10-8.74±0.11/0.1 mL，MDT 为 132.3±0.65 h，ICPI和IVPI结果均为0，表明rL-VP2为温和型病毒，可用于胚胎免疫试验。

2.2 免疫剂量对出雏率和存活率的影响 按不同剂量进行胚胎免疫，3 d后出雏，弃掉弱雏后统计出雏率，剩余的健康雏鸡进行隔离饲养，21 d后统计存活率(表1)。结果表明：高剂量免疫组(第1、2、3组)的出雏率明显低于低剂量组(第5组、6组)和对照组(第8组)；高剂量免疫组的存活率也明显低于低剂量免疫组。另外，104EID50/枚剂量免疫组(第4组)的出雏率和存活率分别为91.4%和93.8%。

2.3 血清中抗NDV抗体水平检测 分别于出雏后第9 d、第14 d和第21 d，由每组随机选择10只雏鸡采血，检测血清中抗NDV抗体的HI滴度(表2)。结果表明：各免疫组在出雏后第9 d能够检测到抗NDV特异性抗体，其中第3组、第4组在第14 d和第21 d的HI滴度均超过5log2。

表1 rL-VP2免疫后对出雏率及3周存活率Table 1 Effect ofin ovovaccination of rL-VP2 on hatchability and 3rd week survivability of hatched chickens

表2 rL-VP2免疫后各组抗NDV抗体效价Table 2 The titeration of HI antibody against NDV in chickens vaccinated with rL-VP2

2.4 血清中抗IBDV抗体水平检测 采用IDEXX公司IBDV抗体检测试剂盒检测出雏后第9 d、第14 d和第21 d各组雏鸡血清中抗IBDV抗体水平(图1)。结果表明：不同剂量免疫组出壳后第9 d均能产生抗IBDV抗体，并且第21 d达到较高水平；高剂量免疫组(第1组～第4组)抗IBDV抗体水平明显高于低剂量免疫组(第5组～第7组)。

2.5 rL-VP2胚胎免疫后的攻毒保护效果 出雏28 d后，分别用NDV强毒F48E9株和vvIBDV Gx株进行攻毒试验(表3)。结果表明：rL-VP2免疫组(104EID50/胚)可同时抵抗F48E9株和Gx株的攻击，雏鸡未出现临床症状，存活率均达到100%(10/10)；而用F48E9株攻击PBS对照组，雏鸡全部发病死亡，存活率为0(0/10)；Gx株攻击PBS对照组全部发病，存活率为40%(4/10)；攻毒试验组的第2组和第4组存活鸡体重分别为198.45 g±54.59 g和158.10 g±28.31 g；BBIX分别为0.96±0.09和0.26±0.12。剖检变化显示：第4组法氏囊严重变形及萎缩，而第2组存活鸡的法氏囊无肉眼可见病变(图片未显示)。以上结果表明：rL-VP2按104EID50/胚的剂量进行胚胎免疫具有良好的安全性和效力，免疫后鸡雏能够对NDV强毒和vvIBDV的攻击产生100%的保护率。

表3 免疫鸡对F48E9株和Gx株的攻击保护效果Table 3 Protections of chickens after challenging with F48E9strain and Gx strain

3 讨论

VP2蛋白是IBDV的主要结构蛋白、宿主保护性抗原以及病毒衣壳的主要成分，与病毒中和抗体的诱导与识别有关[8]。长期以来，各国学者研制表达VP2抗原重组禽腺病毒、重组火鸡疱疹病毒和重组禽痘病毒[9-11]等活载体疫苗相继取得成功，但由于上述表达系统存在诸多不足，均未应用于生产中。

从鸡胚免疫系统的发育过程分析，当鸡胚发育到17胚龄～18胚龄时，其法氏囊结构已经发育完善，免疫系统已基本建立，能够对某些抗原产生较好的免疫应答[12]。与出雏后免疫相比，18胚龄时进行胚胎免疫能够诱导机体更早地出现滴度更高的抗体[5]。目前，已证实用该方法预防马立克氏病、ND、传染性支气管炎、IBD和一些细菌、寄生虫引起的疾病是安全、有效的[4]。在胚胎免疫中，最佳免疫剂量的选择对鸡胚的出雏率、存活率和免疫后抗体水平均有较大影响[13-14]。

本研究应用不同剂量rL-VP2接种18胚龄SPF鸡胚，结果显示104EID50/枚免疫组的出雏率、存活率及免疫后抗体水平均比其他免疫组理想；免疫保护效果显示，该免疫组在出雏28 d时能够同时对NDV强毒和IBDV强毒致死剂量的攻击产生免疫保护作用(存活率达 100%)。由此可以推断，用rL-VP2按104EID50/枚剂量进行胚胎免疫是安全和有效的，rL-VP2有望作为预防ND和IBD的鸡胚接种用疫苗进行推广使用。

胚胎免疫接种要求低，技术难度低，并且目前已经有自动消毒、注射、封洞于一体的鸡胚注射系统，在大型养鸡场推广该技术，能够有效地降低NDV和IBDV对鸡群的危害，减少传统免疫方法造成的应激反应，节约生产成本，具有广阔的应用前景。

[1]Wang X,Fu C,Gao H.Molecular and antigenic characterization of very virulent infectious bursal disease virus strain Gx isolated in China[J].Agricultural Sciences in China,2003,2(5):566-572.

[2]Ge J Y,Deng G H,Wen Z Y,et al.Newcastle disease virus-based live attenuated vaccine completely protects chickens and mice from lethal challenge of homologous and heterologous H5N1 avian influenza viruses[J].J Virol,2007,1(81):150-158.

[3]吴祥辉，刘向萍.蛋内注射技术-家禽免疫新视点[J].中国家禽，2004，26(17)：31-36.

[4]Li C S,Wang L Y,Chou C C.Field evaluation of flock production performance ofin ovoinjection of infectious bursal disease virus immune complex vaccine in commercial broiler farms[J].Poultry Sci,2005,14:338-344.

[5]Saravandava K,Nachimuthu K,Padmanaban V D.Effect of tuftsin on embryo vaccination with newcastle disease virus vaccine[J].Comp Microbiol Infect Dis,2005,28:269-276.

[6]Giambrone J J,Dormitorio T,Brown T.Safety and efficacy of in ovo administration of infectious bursal disease viral vaccines[J].Avian Dis,2001,45:144-148.

[7]世界动物卫生组织著，农业部兽医局/中国动物卫生与流行病学中心译.陆生动物诊断试验和疫苗手册(哺乳动物、禽鸟与蜜蜂)[M].北京：中国农业科学技术出版社，2004：241-242.

[8]Tobias L,Fasseli C,Felix A R,et al.Molecular and structural bases for the antigenicity of VP2 of infectious bursal disease virus[J].J Virol,2007,81(23):12827-12835.

[9]Sheppard M,Werner W,Johnson M,et al.Fowl adenovirus recombinant expressing VP2 of infectious bursal disease virus induces protective immunity against bursal disease[J].Arch Virol,1998,143:915-930.

[10]Tsukamoto K,Saito S,Samaguchi S,et al.Complete,long-lasting protection against lethal infectious bursal disease virus challenge by a single vaccination with an avian herpesvirus vector expressing VP2 antigens[J].J Virol,2002,76:5637-5645.

[11]Heine H G,Boyle D B.Infectious bursal disease virus structural protein VP2 expressed by a fowlpox virus recombinant confers protection against disease in chickens[J].Arch Virol,1993,131:277-292.

[12]彭远义，王豪举，常小宏，等.新城疫鸡胚免疫的研究[J].四川畜牧兽医，1999，1(93)：20.

[13]Dimitrios D,Chen C L,Pete K,et al.The safety and immunogenicity of an in ovo vaccine against newcastle disease virus differ between two lines of chicken[J].Vaccine,2007,25:3972-3799.

[14]Jan M,Cé cile N,Mireille D,et al.Vaccination of chicken embryos with escape mutants of La Sota newcastle disease virus induces a protective immune response[J].Vaccine,2006,24:1756-1765.