王 平 胡建华 冼静雯 王晓炜 袁慧文 李俊鹏

1 深圳市药品检验所(518029)

2 海军潜艇学院(266071)

氟哌利多属丁酰苯类抗精神病药，通过阻断脑内多巴胺受体，促进脑内多巴胺的转化起到抗精神病作用，用于精神分裂症和躁狂症兴奋状态[1]。另外还具有神经安定及增强镇痛药的镇痛作用，与芬太尼合用静脉注射，用于大面积烧伤换药、各种内镜检查。本试验对氟哌利多注射液进行了细菌内毒素检查法的可行性考察，以期对本品进行科学、简捷、敏感的质量检查。

1 仪器与材料

ED115型恒温干燥箱(德国BINDER)；IKAMS3型旋涡混合器(德国IKA)；DKZ-2型电热恒温振荡水槽(上海医用恒温设备厂)。试验所用玻璃器皿均经250℃烘烤2.5h去除外源性细菌内毒素。细菌内毒素工作标准品(CSE):中国药品生物制品检定所，规格1mL，效价150EU/支，批号150601-200861。鲎试剂(TAL):湛江安度斯生物有限公司:敏感度λ0.5EU/mL，批号0808112；λ0.25EU/mL，批号0801111；λ0.125EU/mL，批号0812011。细菌内毒素检查用水(BET水):湛江安度斯生物有限公司，规格25mL，批号0807040。氟哌利多注射液:①上海旭东海普药业有限公司，规格2mL:5mg，批号080202；②山东华鲁制药有限公司，规格2mL:5mg，批号0711151。

2 方法与结果

2.1 供试品细菌内毒素理论限值(L)的确定

按中国药典规定人用每公斤体重每小时最大可接受的注射剂内毒素剂量K=5.0EU/kg，该制剂人用每小时最大剂量M=10mg/60kg，根据公式L=K/M，计算得该注射剂内毒素限值L为30 EU/mg。

2.2 鲎试剂敏感度(λ)复核

按《中国药典》2005年版二部附录细菌内毒素检查法进行敏感度复核实验[2]。将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15min，然后稀释成2λ、λ、0.5λ、0.25λ等系列浓度，依法进行试验，结果表明所用TAL敏感度均在0.5λ～2λ范围内，符合规定，见表1。

2.3 供试品最大有效稀释倍数(MVD)

根据药典规定，供试品最大有效稀释倍数MVD=cL/λ，其中L为氟哌利多注射液的细菌内毒素限值30EU/mg，c为氟哌利多注射液的浓度5mg/2mL，即2.5mg/mL，λ为鲎试剂标示敏感度。若取λ为0.5、0.25、0.125 EU/ml，则氟哌利多注射液的对应有效稀释倍数为:D0.5=2.5*30/0.5=150倍；D0.25=2.5*30/0.25=300倍；D0.125=2.5*30/0.125=600倍。

2.4 干扰预试验

将氟哌利多注射液用细菌内毒素检查用水分别稀释到3、7.5、75、150、300倍。

在上述试验液中加入等量的细菌内毒素检查用水制成6、15、150、300、600倍的稀释溶液，浓度分别为420、170、17、8.3、4.2μg/mL，将此系列浓度溶液记为NPC；另外在上述试验液中加入等量的4λ浓度的细菌内毒素标准溶液，使每一浓度的试验液中均含有2λ浓度的细菌内毒素，记此系列浓度溶液记为PPC。

表1 TAL敏感度复核结果

表2 氟哌利多注射液干扰预试验结果(湛江安度斯生物有限公司，λ=0.25EU/mL，lot No. 0801111；λ=0.125EU/mL，lot No. 0812011)

表3 氟哌利多注射液正式干扰试验结果(湛江安度斯生物有限公司，λ=0.25EU/mL，lot No. 0801111；λ=0.125EU/mL，lot No. 0812011)

表4 供试品细菌内毒素检查结果(湛江安度斯生物有限公司，λ=0.5EU/mL，lot No. 0808112)

取敏感度为0.25EU/mL和0.125EU/mL的两种鲎试剂，分别与上述PPC和NPC进行反应，每一浓度重复两管，并设阳性和阴性对照，进行干扰预试验，结果见表2。

由以上干扰预试验结果可以初步了解:两批氟哌利多注射液对细菌内毒素检查最大不干扰浓度可能为17μg/mL，可在此浓度下进行正式干扰试验。

2.5 正式干扰试验

将氟哌利多注射液用细菌内毒素检查用水稀释到75倍，作为供试品1/2MVD溶液，浓度为34μg/mL。

取敏感度为0.25EU/mL和0.125EU/mL的两种鲎试剂，分别加入2λ、λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液和含2λ、λ、0.5λ、0.25λ的内毒素的供试品溶液进行反应，每一浓度重复4管，并设分别加入检查用水和供试品溶液的阴性对照和样品阴性对照，各重复两管。正式干扰试验结果见表3。

上述试验结果表明，Es/Et比值均在0.5～2.0，本供试品浓度为17μg/mL时不干扰鲎试剂与细菌内毒素的凝集反应，可按低于或等于此浓度进行细菌内毒素检查。

2.5 供试品细菌内毒素检查

按中国药典细菌内毒素检查法，使用0.5EU/mL的鲎试剂对样品进行细菌内毒素检查，并同时设立样品的自身阳性对照管，结果见表4。

经内毒素干扰试验，当样品稀释至17μg/mL以下浓度时对内毒素和鲎试剂反应无干扰作用，可采用凝胶法对样品进行内毒素检查。

3 讨 论

热原检查法或细菌内毒素检查法是注射制剂质量控制的关键指标之一。热原检查法比较成熟，目前药典和其他国家标准中有很多品种均采用该法，但易受试验动物个体差异、方法敏感度、 药物本身性质(某些药物如乳糖酸红霉素引起降温，青霉素往往也有类似作用，两性霉素 B可引起升温)等影响，使用受到一定限制。细菌内毒素检查法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应，检测供试品中细菌内毒素限量的方法，由于方法敏感度高、准确、快速和经济等优点，已在各国药典中得到推广。此外，随着实验动物福利制度的发展，动物实验替代方法理论(简称3R理论，即减少、替代、优化)已经成为科学实验的重要指导原则，药品的细菌内毒素检查法已经成为热原检查法的重要替代方法[3]，研究药品的细菌内毒素检查法的可行性是实践动物福利制度的重要体现。

[1]杨世杰,王怀良.药理学[M].北京:人民卫生出版社,2001:253-254.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:化学工业出版社,2005:附录 85-88.

[3]宁磊,吴祥林.实验动物福利与“3 R” 原则[J].微生物学免疫学进展,2006,34(3):53-56.