李翠莹 安群星 甘新宇 (成都军区总医院输血科,成都 610083)

获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是一种由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的严重传染病,迄今仍缺乏特别有效的治疗方法。HIV-1辅受体及其基因多态性的发现给AIDS的治疗研究带来新的契机。CCR5和CXCR4是HIV-1最为主要的辅受体,CCR5辅受体在人群中存在有多种突变,其中CCR5Delta32是一种最常见、也是最重要的辅受体突变形式。据研究[1-5],CCR5Delta32纯合子突变个体能有效抵制HIV-1感染,其杂合子个体也不易被HIV-1感染或感染后病程进展缓慢。我们从CCR5Delta32突变个体获得目的基因并将其克隆至pLenti6/V5-D-TOPO载体,经慢病毒包装后转染人外周血单个核细胞(PBMCs),研究目的基因的表达对靶细胞表面HIV-1辅受体CCR5和CXCR4的抑制作用。这些工作为今后AIDS的基因治疗研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料 E.coli DH5α菌株和293T细胞为本室保存。载体 pUCm-T、pLP1、pLP2、pLP/VSVG 和 pLenti6/V5-D-TOPO均购自Invitrogen公司。基因组DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司,胶回收试剂盒购自宝信公司,质粒快速提取试剂盒购自Promega公司。Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶,以及限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ和 PstⅠ均购自 TaKaRa公司。转染试剂GeneCompanionⅡ购自GeneTrans公司,培养基DMEM+10%胎牛血清购自Hyclone公司。Anti-CD4-FITC、Anti-CCR5-PE和Anti-CXCR4-PE-Cy5购自eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 重组慢病毒载体的构建及包装 从CCR5Delta32突变个体外周血提取基因组DNA,以其为模板利用设计的一对引物进行PCR扩增。将扩增产物克隆至pLenti6/V5-D-TOPO载体,随后转化E.coli DH5α宿主菌。碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定及测序。用 pLP1、pLP2、pLP/VSVG 及pLenti-CCR5Delta32四种质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒液并测定其滴度。

1.2.2 重组慢病毒转染PBMCs 用淋巴细胞分离液从新鲜外周血中提取PBMCs,用10%FCS RPMI1640 培养液(含 10 μ g/ml PHA,100 U/ml rIL-2)培养48小时。……