徐育冬 宋新梅 靳洪涛 张绍君 (河北医科大学第二医院风湿免疫科,石家庄 050000)

血管新生在胚胎发生和创伤愈合中是一个基本生理过程,但在类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)、肿瘤、糖尿病视网膜病变和银屑病等病理过程中也具有重要作用[1]。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)在促进滑膜局部血管新生中具有重要作用,血管增殖确保了滑膜血管翳的发生和成长,是RA发生和发展的中心环节,并且促进了软骨和骨的破坏及关节重塑,最终造成关节畸形和强直,功能丧失。关节炎动物实验表明,在RA的过程中阻断血管生成是一种有效的治疗方法[2]。本实验旨在观察佐剂性关节炎大鼠(AA)膝关节滑膜VEGF、HIF-1α的表达。为RA滑膜血管翳形成寻找实验证据及临床抑制RA滑膜血管翳生成提供理论依据及有效切入点。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 Wistar大鼠30只,雄性,体重140～160克,由河北省实验动物中心提供,合格证号802120,许可证号SCXK(冀)2003-1-003。

完全弗氏佐剂(FCA,10 ml)购于Sigma公司;VEGF、HIF-1α免疫组化成套试剂盒购自深圳晶美生物制品公司;卡介苗(BCG,50 mg/支)购自华瑞创新生物科技开发中心。

1.2 分组及AA大鼠模型的建立 将30只雄性Wistar大鼠随机分为2组,设正常对照组10只,造模组20只。将FCA与卡介苗配置为(含BCG 10 mg/ml)的水包油乳剂。试验第一天造模组20只大鼠的尾根部皮内注射该乳剂0.2 ml致炎,正常对照组大鼠的尾根部皮内注射等量生理盐水。

1.3 病理学及免疫组织化学检测 于致炎后第28天,处死所有大鼠并取膝关节滑膜组织,置于4%多聚甲醛固定液中固定,以备作病理及免疫组织化学检测。常规HE染色并计算滑膜病理积分,按照炎症程度不同分别评分[3]:0分:正常;1分:极少炎性细胞浸润或(和)组织轻微水肿;2分:轻微浸润;3分:中等浸润;4分:明显浸润;5分:严重浸润。

免疫组化检测用SABC(链霉亲和素生物素酶复合物)法,HIF-1α和VEGF阳性滑膜细胞均呈颗粒状棕黄色或棕褐色。采用真彩色图像分析系统对HIF-1α和VEGF表达强度进行定量分析。方法[4]如下:每张切片随机选取5个视野(×400),系统自动测量出阳性染色部位的积分光密度(IOD),5个视野的平均IOD值代表该切片HIF-1α和VEGF的表达情况。

2 结果

2.1 实验动物入选情况 造模组大鼠共有11只大鼠造模成功,其间死亡1只。最后造模组入选大鼠10只。

2.2 大鼠滑膜病理学改变及病理学评分 见图1、2。正常大鼠滑膜衬里层有1～2层滑膜细胞组成,且部分不连续。滑膜衬里层下层为由脂肪细胞、少量成纤维细胞、巨噬细胞和少量血管组成的结缔组织。滑膜组织无炎性细胞浸润,无纤维组织增生。而AA大鼠可见滑膜组织中等量淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞浸润,平均病理积分3.8±0.45,滑膜衬里层增生达4～6层(表1)。

图1 正常对照组(HE)(×400)Fig.1 The normal synovium(HE)(×400)

2.3 滑膜组织HIF-1和VEGF的表达 见图3～6。正常对照组大鼠滑膜组织均有少量HIF-1和VEGF的表达。而造模组滑膜组织HIF-1和VEGF均明显高于正常对照组(P＜0.01)(表2)。

图2 模型对照组(HE)(×400)Fig.2 The hyperplastic synovium(HE)(×400)

表1 大鼠膝关节滑膜病理积分(±s)Tab.1 Histopathological integration of synovial membrane(±s)

表1 大鼠膝关节滑膜病理积分(±s)Tab.1 Histopathological integration of synovial membrane(±s)

Note:P＜0.01 compared with control group.

Groups n 28 d Control 10 0 AA 10 3.8±0.45

图3 正常对照组VEGF表达(×400)Fig.3 The expression of VEGF of synoviumin normal rat(×400)

图4 模型对照组VEGF表达(×400)Fig.4 The expression of VEGF of synoviumin AArat(×400)

图5 正常对照组HIF-1α表达(×400)Fig.5 The expression of HIF-1αof synovium in normal rat(×400)

图6 模型对照组HIF-1α表达(×400)Fig.6 The expression of HIF-1αof synovium in AA rat(×400)

表2 滑膜组织HIF-1α和 VEGF的积分光密度值(±s)Tab.2 IOD of HIF-1αand VEGF of synovium( ±s)

表2 滑膜组织HIF-1α和 VEGF的积分光密度值(±s)Tab.2 IOD of HIF-1αand VEGF of synovium( ±s)

Note:P＜0.01 compared with control group.

Groups n HIF-1α VEGF Control 10 176.74±50.95 192.71±14.22 AA 10 1 002.75±238.44 1 030.30±247.80

2.4 滑膜病理学评分与HIF-1和VEGF表达的相关性 滑膜组织病理积分与HIF-1α、VEGF的IOD值均成直线正相关,分别为r=0.810(P＜0.01),r=0.778(P＜0.01)。滑膜组织HIF-1α和VEGF之间的IOD值成直线正相关,r=0.890(P＜0.01)。

3 讨论

HIF-1是促进血管新生的关键因子,可能在RA发病机制中起重要作用。HIF是一种调节细胞氧平衡和缺氧反应基因表达的核转录因子,HIF-1α更为重要。HIF-1是缺氧状态下血管生成的核心调控因子,通过调控其他因子的表达,直接参与血管生成[5],而VEFG是血管生成初期关键性生长因子。HIF-1对VEFG调控表现为:①HIF-1能够启动VEGF转录;②缺氧时VEGF mRNA稳定性增加;③HIF-1还可以上调VEGFR1转录,加强VEGF生物学效应[6]。血管生成效应主要是VEGF激活VEGFR2的结果。VEGF表达升高的主要原因是HIF-1α表达增加,通过与VEGF启动基因内的缺氧反应元件(HRE)结合,使VEGF表达升高[1]。VEGF也是导致滑膜炎症和血管生成的主要因子。VEGF的生理功能[7]:①促进血管内皮细胞有丝分裂和血管新生;②增强血管通透性,促进血管内物质渗出,从而促进慢性炎症形成和发展。本实验发现正常滑膜组织也少量表达 HIF-1α和VEFG,提示 HIF-1α和 VEFG 在维持滑膜正常功能中起一定作用。而AA大鼠滑膜衬里层增生达4～6层,可见滑膜组织中等量淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞浸润。HIF-1α和VEFG的表达明显高于正常对照组,且与病理学评分成直线正相关,表明过度表达的HIF-1α和VEFG可能是滑膜炎症发生和进展过程中的重要的细胞因子,在滑膜血管翳的形成和滑膜增生中具有重要作用。HIF-1α和VEFG的表达呈直线正相关,提示二者在滑膜血管的增生中可互相影响共同促进滑膜血管翳的形成。细胞因子在RA发病机制中至关重要,是炎症和损伤的重要递质,在临床治疗RA能否抑制或拮抗关节滑膜局部HIF-1α和VEFG表达,从而抑制滑膜血管翳增生及骨关节的破坏还有待深入研究,为临床治疗RA提供新思路。

1 Bouis D,Kusumanto Y,Meijer C et al.A review on pro-and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention[J].Pharmacol Res,2006;53:89-103.

2 Paleolog EM,Miotla JM.Rheumatoid arthritis:A target for antiangiogenic therapy?[J].Humana PressInc,2001;8(6):129-149.

3 张 晶,左晓霞,李 通 et al.沙利度胺对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用及其对炎性细胞因子的影响[J].中华风湿病学杂志,2005;9(11):656-659.

4 Peters C L,Morris C J,Mapp P I et al.The transcription factors hypoxiainducible factor 1αand ets-1 colocalize in the hypoxic synovium of inflamed joints in adjuvant-induced arthritis[J].Arthritis Rheumm,2004;50(1):291-296.

5 Gaber T,Dziurla R,Tripmacher R et al.Hypoxia inducible factor(HIF)in rheumatology:low O2!See what HIF can do![J].Ann Rheum Dis,2005;64:971-980.

6 DistlerK.Hypoxia and angiogenesis in rheumatic diseases[J].Z Rheumatol,2003;62(Suppl2):43-45.

7 Zachary I.VEGF signalling:integration and multi-tasking in endothelial cell biology[J].Biochem Soc Trans,2003;31:1171-1177.