元小冬 王淑娟 许亚茹 李 静 杨 娜 李宏芬

(华北煤炭医学院附属开滦医院神经内科,唐山 630000)

血浆纤维蛋白原(Fg)浓度和分子聚合活性异常是缺血性脑血管疾病的重要危险因素,Fg作为一种主要由肝脏合成的大分子糖蛋白,每个单位由3对对称排列的多肽链Aα、Bβ和γ组成,它的合成、分泌和分子活性受遗传和环境因素的影响[1-3],而Fg合成的基因调控是其重要的遗传决定因素,同时Fg基因多态性作为脑梗死疾病的遗传易感因素已引起了广泛的重视。目前认为FgBβ链的mRNA合成是控制Fg整个分子合成的限速步骤,同时已发现FgBβ链有多个基因多态性位点,它们可能与Fg合成的基因调控和功能表达有关,但其具体机制尚不清楚。本项研究通过对不同类型脑梗死患者FgBβ链5′端启动子区、翻译区和3′端非翻译区六个主要代表性多态性位点的基因多态性与血浆Fg浓度和分子聚合活性功能表达等相关因素进行研究,分析FgBβ链主要基因多态性位点等遗传因素对血浆Fg功能表达的基因调控作用及其与脑梗死类型的关联性,从而探讨不同类型脑梗死的发病机制,寻找脑梗死发病的可能遗传基础,从而为脑梗死高危人群的风险预测和制定个体化防治方案提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

1.1.1 病例组的选取 选取在开滦医院神经内科住院并经临床和头CT或MRI扫描证实的急性脑梗死患者160例,依据头CT或MRI显示病灶的形态学特征将其分为两组[4]:①脑动脉主干支梗死组(Main-trunk arterial cerebral infarction,MCI,n=54):男39例、女15例,年龄(63.25±14.07)岁,CT显示的病灶主要分布于额、颞、顶、枕各脑叶的皮层或皮层下,其病灶呈扇形、楔形大片低密度影或相应MRI表现。②脑动脉穿通支梗死组(Penetrating arterial cerebral infarction,PCI,n=106):男74例 、女32 例,年龄(63.94±11.48)岁,CT显示病灶主要为分布于内囊、壳核、尾状核、丘脑附近及侧脑室旁,形态呈类圆形或椭圆形的小软化灶或有相应的MRI表现。

1.1.2 正常对照组的选取 选取同时期在开滦医院进行健康查体,并与病例组在年龄和性别等方面相匹配,且检查结果均正常的志愿者160人,其中男113例、女47例,年龄(65.05±8.73)岁。所有样本已除外有明确肿瘤和其它明显脑动脉栓子来源的患者。

1.2 实验室检测

1.2.1 血生化及Fg浓度及分子聚合活性系列指标的测定 病例组均于发病24小时内、对照组于体检

当日抽取清晨空腹静脉血8～10 ml,其中3 ml以3 000 r/min离心10分钟,吸取血清应用全自动生化仪测定血糖(Glu)、谷丙转氨酶(ALT)、甘油三脂(TG)、胆固醇(CHO)、极低密度脂蛋白(VLDL)等项血生化指标;另取3 ml,加0.13 mol/L枸橼酸钠抗凝剂0.3 ml混匀,以2 000 r/min离心 10分钟,吸取血浆测定Fg浓度、纤维蛋白单体聚合速率(FMPV)、最大光密度值(Amax)、FMPV/Amax等指标[5]。

1.2.2 FgBβ链六位点的基因型检测 将剩余血标本加2%EDTA 0.3 ml抗凝,低渗法分离白细胞,酚/氯仿法提取DNA,然后应用聚合酶链反应(PCR)扩增目的DNA,引物序列见表1;PCR扩增体系:PCR总反应体系为25 μ l,其中双蒸水 15.1 μ l,10×Buffer 2.5 μ l,MgCl2溶液 1.6 μ l(2.5 mol/L),4×dNTP 混合物 2 μ l,上游引物和下游引物 2 μ l,Taq 酶 0.8 μ l,模板DNA为1 μ l;PCR循环条件:94℃预变性240秒→94℃变性60秒→60℃退火 60秒→72℃延伸90秒,循环30次,72℃后延伸300秒。

1.2.2.1 限制性内切酶酶切PCR扩增产物 Bβ-854酶切体系 20 μ l,其中双蒸水 7 μ l、PCR 产物 10 μ l、EcoRI内切酶 1 μ l(10 U)、EcoRI 缓冲液 2 μ l;Bβ-455 酶切体系 20 μ l,其中无菌去离子水 9 μ l、Buffer 2 μ l、HaeⅢ 1 μ l、扩增产物 8 μ l,37 ℃水浴 12 小时;Bβ-249 酶切体系 20 μ l,包括无菌去离子水 9 μ l、Buffer 2 μ l、Bsp1286I 1 μ l、扩增产物 8 μ l,37 ℃水浴 12 小时;Bβ-148 酶切体系 20 μ l,其中双蒸水 13 μ l、BufferE 2 μ l、BSA 0.2 μ l、Hind Ⅲ0.8 μ l(8 U)、扩增产物 4 μ l,37℃水浴 16 小时 ;Bβ448 酶切体系 20 μ l,其中双蒸水 13.2 μ l、MnlⅠ 0.8 μ l(8 U)、BufferG 2 μ l、扩增产物4 μ l,37℃水浴16 小时 ;Bcl-1酶切体系20 μ l,其中双蒸水 7 μ l、BufferG+缓冲液 2 μ l、Bcl-1 内切酶 1 μ l(10 U)、扩增产物 10 μ l,37℃水浴16小时。

1.2.2.2 DNA定性 将酶切产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳,紫外灯下观察记录Fg六个多态性位点的各基因型(顺序为野生型、变异杂合子、变异纯合子):Bβ-854、-455、Bcl-1 及 448 均为 GG 、GA 、AA 型;FgBβ-249、-148 则可见 CC、CT、TT 三种基因型。

1.3 资料的统计学分析 全部资料应用Excel建库,将所有非定量指标数量化,采用SAS(8.12)统计软件包进行统计学分析。FgBβ链基因位点之间的遗传连锁不平衡关系进行Kappa一致性检验分析。

2 结果

2.1 研究对象的临床资料分析 三组年龄、性别构成无显著性差异(F=0.70,P=0.4997,χ2=0.158,P=0.924),MCI和PCI组收缩压、舒张压、体重指数、TG、GLU、VLDL 、FMPV 均高于对照组;MCI组 Fg浓度、FMPV/Amax高于对照组,TG、VLDL低于PCI组(表2)。

2.2 FgBβ各位点等位基因分布与脑梗死类型的关系 根据基因记数方法计算等位基因频率,Bβ-854 A和Bcl-1A等位基因在MCI、PCI组和对照组间分布频率有统计学差异(19%,17%,10%;21%,17%,16%;P＜0.05),其余位点各组间等位基因分布频率均无显著性差异(P＞0.05)。同时,对于脑梗死组和对照组六个位点等位基因进行Hardy-Weinberg平衡吻合度检验,除Bβ-455等位基因分布频率不符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ2=4.262,P＜0.05;χ2=11.472,P＜0.05)外,其余五个位点期望值与观察值之间无显著性差异(P＞0.05),分布均符合Hardy-Weinberg平衡。

2.3 FgBβ各位点基因型和连锁基因型与脑梗死类型的关系 FgBβ-854、Bcl-1为GG型分布频率占优势,MCI和PCI组的GA、AA型分布频率高于对照组(-854χ2=15.004 1,P=0.004 7;χ2=0.478 5,P=0.033 1);其余位点各组间基因型分布差异均无显著性(P＞0.05)(表3)。因Fg Bβ各位点变异纯合子基因型样本较少,故将其与变异杂合子基因型进行并组分析。进行Kappa一致性检验分析显示Fg Bβ-854G/A 与-455G/A、-249C/T 及 Bcl-1C/T 之 间,Bβ-249 C/T 与-148C/T、Bcl-1G/A 之间为随机分布;Bβ-854G/A 与-148C/T、448G/A,-249C/T 与-455G/A、448G/A之间一致性极差,近于随机分布;BβBcl-1C/T与-455G/A、-148C/T之间为松散连锁不平衡关系;Bβ-455G/A 与-148C/T、448G/A、-148C/T 与 448G/A之间存在强连锁不平衡关系。三组 Bβ-455、-148、448各连锁基因型分布频率的差异无显著性(P＞0.05)。

2.4 FgBβ六位点基因多态性与Fg系列指标及脑梗死类型的关系 FgBβ-854G/A在对照组和PCI组中GG和GA+AA型人群间Fg浓度、FMPV、Amax及FMPV/Amax无统计学差异(P＞0.05),MCI组也仅GA+AA型的Amax高于GG型(0.21±0.03,0.19±0.03,P＜0.05),其余指标亦均无统计学差异(P＞0.05);Bβ-455G/A在三组中GG和GA+AA型人群间Fg浓度、FMPV、Amax及FMPV/Amax均无统计学差异(P ＞0.05);人群间 Fg浓度 、FMPV 、Amax、FMPV/Amax无统计学差异(P＞0.05),在MCI组CT+TT型人群Fg、FMPV低于CC型(403±88.68,501±43.34;0.72±0.12,0.83±0.06;P＜0.05),其余指标CT+TT型和CC型间无差异 (P＞0.05);Bβ-148C/T在对照组CT+TT型人群Amax高于CC型人群(0.20±0.12,0.16±0.04;P＜0.05),PCI组CT+TT型人群FMPV/Amax高于CC型(3.81±0.36,3.65±0.42;P＜0.05),MCI组CT+TT型与CC型人群间 Fg各指标均无差异性(P＞0.05);Bβ448G/A在对照组和PCI组GA+AA型与GG型人群间Fg系列指标均无差异性(P＞0.05),MCI组GA+AA型人群Fg、FMPV高于GG型(450±85.63,398±88.47;0.78±0.12,0.71±0.11;P＜0.05)。BβBcl-1G/A在对照组GA+AA型Fg浓度高于GG型(420±83.97,369±95.09;P＜0.05),其余指标在GA+AA型和GG型间无差异(P＞0.05);在PCI组GA+AA型FMPV高于GG型(0.74±0.11,0.69±0.11;P＜0.05),其余指标GA+AA型和GG型间无差异(P＞0.05);MCI组GA+AA型和GG型间Fg浓度、FMPVAmax、FMPV/Amax无统计学差异(P＞0.05)。

表1 PCR各基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of six genes

表2 不同类型脑梗死与对照组的临床指标比较(±s)Tab.2 The clinical indicators comparison of different cerebral infarction types with the control group( ±s)

表2 不同类型脑梗死与对照组的临床指标比较(±s)Tab.2 The clinical indicators comparison of different cerebral infarction types with the control group( ±s)

Note:Application analysis of SNK:1),2),3)indicated that there were significant differences between the MCI group and the control group,the PCI group and the control group,the MCI and the PCI group,respectively(P＜0.05).

Indicators MCI cases(n=54) PCI cases(n=106) Controls(n=160) F P Age(y) 63.25±14.07 63.94±11.48 65.05±8.73 0.70 0.499 7 SBP(mmHg) 150.56±28.52 150.08±25.61 125.89±12.891)2) 55.31 ＜0.000 1 DBP(mmHg) 85.71±12.84 87.05±13.72 79.15±8.271)2) 18.29 ＜0.000 1 BMI(kg/m2) 24.98±9.75 25.29±10.44 22.91±6.471)2) 20.08 ＜0.000 1 TG(mmol/L) 1.48±0.86 1.82±1.06 1.21±0.611)2)3) 17.49 ＜0.000 1 CHO(mmol/L) 5.34±1.38 5.35±1.36 5.11±0.95 1.66 0.191 2 GLU(mmol/L) 6.08±2.44 6.50±3.39 4.87±0.741)2) 18.12 ＜0.000 1 VLDL(mmol/L) 0.30±0.17 0.36±0.21 0.24±0.121)2)3) 17.52 ＜0.000 1 Fg concentration(mg/dl) 418.17±87.11 399.09±89.59 379.59±94.141) 3.97 0.019 9 FMPV 0.74±0.12 0.71±0.12 0.64±0.181)2) 11.89 ＜0.000 1 Amax 0.20±0.03 0.20±0.05 0.19±0.10 0.43 0.652 5 FMPV/Amax 3.80±0.80 3.70±0.43 3.65±0.441) 2.55 0.079 4

表3 FgB β各位点基因型与脑梗死类型的关系Tab.3 Relationship between the six sites'genotypes and cerebral infarction types

表4 以脑梗死与否为因变量的Logistic回归分析结果Tab.4 Logistic regression analysis of cerebral infarction as the dependent variable

表5 以PCI为因变量的Logistic回归分析Tab.5 Logistic regression analysis of PCI as the dependent variable

2.5 Fg系列指标的多因素分析结果 以Fg浓度为因变量进行多元逐步回归分析,依次筛选出脑梗死类型、年龄、FMPV/Amax、Bcl-1基因型,标准化回归系数(β)分别为 0.11、0.12、0.16、0.20,P ＜0.01;以FMPV为因变量依次筛选出脑梗死类型、Amax、-249基因型 ,β 为 0.27、0.29、-0.13,P ＜0.01;以Amax为因变量仅筛选出FMPV,β为0.32,P＜0.01;以FMPV/Amax为因变量则依次筛选出脑梗死类型、饮酒 、TG 、Fg 浓度 、-148基因型 ,β为 0.12、-0.17、0.16、0.15、0.16,P ＜0.01 。

2.6 脑梗死类型的影响因素分析 以脑梗死与否为因变量的Logistic回归分析依次筛选出吸烟史、SBP 、BMI、Glu、FMPV 、Bcl-1(表 4);以 MCI(MCI为 1,对照为 0)为因变量筛选出吸烟史、SBP、BMI、Glu、FMPV、Bcl-1,OR 值分别为 10.07、1.08、1.17、1.78、68.46、4.08;以PCI为因变量则筛选出吸烟史、SBP、BMI、Glu 、VLDL 、FMPV(表 5)。

3 讨论

本项研究各组间的年龄、性别构成比无显著性差异,表明MCI组、PCI组及对照组的资料选择匹配,具有可比性。本项研究发现MCI和PCI组的收缩压、舒张压、体重指数、TG、Glu、VLDL、FMPV 均高于对照组,提示这些因素是脑梗死疾病的危险因素;而MCI组 Fg浓度、FMPV/Amax高于对照组,TG、VLDL低于PCI组,说明PCI患者血浆Fg单体的聚集功能增强,同时具有以TG为主的血脂代谢异常,而MCI患者不但血浆纤维蛋白单体的聚合功能增强,而且具有血浆Fg含量升高和Fg分子活性增强,因此血浆Fg浓度、FMPV/Amax及FMPV同时异常是MCI的独立危险因素,而仅有FMPV和TG异常则是发生PCI的危险因素。这与文献报道血浆Fg含量及其分子聚合功能异常是脑梗死疾病重要危险因素的结果相同[6-10]。

脑梗死组和对照组六个位点等位基因的Hardy-Weinberg平衡吻合度检验结果表明,除Bβ-455等位基因的分布频率外,其余五个位点均符合Hardy-Weinberg平衡,表明本项研究选择的样本具有可靠性和群体代表性,而多态性位点的基因遗传连锁不平衡分析显示 Bβ-455G/A与-148C/T和 448G/A,-148C/T与448G/A之间存在着强连锁不平衡关系,因此我们进行这些位点的连锁基因型分析,结果显示三组 Bβ-455、Bβ-148 、Bβ448 之间各连锁基因型的分布频率无统计学差异,从而提示这些存在强连锁不平衡关系位点间的连锁基因型与脑梗死类型无明显的相关性。

目前的研究表明血浆Fg浓度和分子聚合功能的表达主要通过Fg的基因进行调控[11-14],Fg的三对多肽链分别由其各自独立转录的mRNA指导合成,其中Bβ链mRNA的合成是整个Fg分子合成的限速步骤,而其具有多态性的位点可能是其基因表达的重要调控部位。在FgBβ链转录起始点上游,即5′端启动子区存在着多个调控区和位点,其中本项研究的FgBβ-854、-455、-249、-148 均位于此区。由上述单因素及多因素分析结果发现FgBβ链5′端启动子区仅Bβ-854等位基因A和变异基因型与脑梗死疾病有关,Bβ-854和-455位点基因多态性对于血浆Fg浓度及分子聚合活性的功能表达没有明显的调控作用,但在某些情况下可引起纤维蛋白单体最大聚合速率发生异常,而易发MCI,而Bβ-455与脑梗死的类型也无明显的关系;同时Bβ-249基因多态性是调控血浆FMPV功能表达的重要位点,吸烟可使其野生型的功能表达增强,而变异基因型的功能表达减弱而呈保护作用;Bβ-148则是调控血浆Fg分子聚合功能的重要位点,当其FMPV/Amax表达增强时易发PCI。

在FgBβ链翻译区的448基因多态性位点显示在三组间的等位基因分布频率无显著差异性,提示FgBβ翻译区448位点在三组间的等位基因和基因型的频率分布趋势相同,与脑梗死疾病类型无明显的关系。同样,Bβ448变异基因型与野生型人群间Fg系列指标在对照组和PCI组中均无差异性,但MCI组的变异基因型人群Fg、FMPV高于野生型,多因素分析没有发现此位点的基因多态性与血浆Fg浓度和分子功能表达有关,说明在正常情况下翻译区448位点基因多态性与血浆Fg浓度和分子功能表达无关系,但在MCI时其变异基因型人群具有血浆Fg浓度和纤维蛋白单体聚合速率的表达增强。

本项研究显示在FgBβ链3′端的Bcl-1位点等位基因A和变异基因型与脑梗死类型有关;在对照组Bcl-1变异基因型仅Fg浓度高于野生型,且以血浆Fg浓度为因变量进行多元逐步回归分析依次筛选出脑梗死类型、Bcl-1G/A、年龄,这证实Bcl-1位点是血浆Fg浓度表达的重要基因调控位点和影响脑梗死类型的重要因素,在变异基因型和年龄增大时其表达增强;另外,PCI组变异基因型仅FMPV高于野生型;以有无脑梗死为因变量进行logistic回归分析发现吸烟 、SBP 、BMI、Glu 、FMPV 、Bcl-1 是其重要影响因素,且后两者的危险度为41.09、2.28,同样以MCI为因变量也筛选出上述六个因素,但后两者的危险度分别上升到68.46、4.08,而且吸烟的危险度也由7.63上升到10.07,以PCI为因变量则筛选出吸烟、VLDL、FMPV等因素,其危险度分别达7.27、19.43、26.19,而未发现各多态性位点与之有相关性,这进一步证明脑梗死是遗传和环境因素共同作用所致,Bcl-1变异基因型人群是脑梗死疾病,尤其是MCI的遗传易感人群,其变异基因型在吸烟、血脂代谢异常等特定条件下可使血浆纤维蛋白单体聚合功能表达增强易发PCI,而在血浆Fg浓度和纤维蛋白单体聚合功能表达均增强时则易发MCI。

综上所述,血浆Fg浓度、FMPV/Amax及FMPV同时异常是MCI的独立危险因素,而仅FMPV和TG异常是PCI的危险因素;5′端启动子区Bβ-854A等位基因携带者是脑梗死的易感人群,Bβ-249C/T是影响血浆FMPV功能表达的重要位点,其变异基因型可使血浆FMPV功能表达减弱而呈现保护作用,吸烟可使其野生型的功能表达增强;Bβ-148位点是调控血浆Fg分子聚合功能的重要部位,并与脑梗死的类型有明显关联性;FgBβ翻译区448位点与脑梗死疾病类型无明显的关系;3′端Bcl-1位点是血浆Fg浓度表达的重要基因调控位点,其变异基因型人群是脑梗死疾病,尤其是MCI的遗传易感人群,变异基因型在吸烟、血脂代谢异常等特定条件下可使血浆纤维蛋白单体聚合功能表达增强易发PCI,而在血浆Fg浓度和纤维蛋白单体聚合功能表达均增强时则易发MCI,因此,脑梗死疾病是遗传和环境因素共同作用的结果。

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