李 燕 郝志勇 陈晓光 (中国医学科学院药物研究所,北京100050)

人类PPARγ基因定位于染色体3p25上,其基因组结构覆盖100 kb。共含有9个外显子,477个氨基酸。通过选择性转录和选择性拼接产生4种PPARγ基因。PPARγ共有4个启动子分别对应于4种 PPARγ mRNA:PPARγ 1、 PPARγ 2、 PPARγ 3 和PPARγ 4,产生相应的蛋白产物;基因 PPARγ 1 5′-端非翻译区包含外显子A1、A2,基因PPARγ 2含有外显子B编码的28个氨基酸,基因PPARγ 3 5′-端非翻译区仅包含外显子A2[1]。

PPARγ具有广泛的组织表达,近年来国内外研究表明,PPARγ在许多人癌细胞系中高表达,如脂肪瘤、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌和胃癌等[2]。

鉴于 PPARγ在肿瘤发生发展中的作用,及PPARγ 2与细胞分化的密切关系,为了便于在今后的工作中进一步探讨hPPARγ 2的功能,在本研究中,我们利用自行构建的 pMD18-T/hPPARγ 2亚克隆,扩增出hPPARγ 2前 1 017 bp的 cDNA,进行了原核表达,并用原核表达的重组hPPARγ 2蛋白免疫动物,获得了特异性抗 hPPARγ 2的单克隆抗体 1B4、3H2、3H10、10D6和10D8。这些抗体的制备为进一步的hPPARγ 2功能研究提供了必要的手段和物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株及实验动物 SP20人骨髓瘤细胞,以含10%FCS的RPMI1640培养基进行悬浮培养,为基础所免疫室馈赠。BALB/c近交系小鼠,4～10周,雌性,购自中国医学科学院动物所繁育中心。

1.1.2 工具酶及试剂 Tag plus DNA聚合酶、pMD-18T Easy Vector System为TaKaRa公司产品;小量质粒制备试剂盒、AMV逆转录酶、Oligo(dT)15Primer、RNA酶抑制剂以及KpnⅠ 、XholⅠ 、EcoR Ⅰ、BamHⅠ、NotⅠ等限制性内切酶均购自Promega公司;Trizol试剂、细胞培养用RPMI1640为Gibco BRL公司产品;HisTrap kit Ni2+亲和柱为美国安玛西亚公司产品;丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺为Sigma公司产品;X-gal、IPTG 为Promega公司产品;琼脂糖、氨苄青霉素等均为国产优级纯或分析纯试剂;弗氏完全佐剂和不完全佐剂购自Sigma公司;PEG、HAT为Gibco BRL公司产品;HiTrap亲和柱为安玛西亚公司产品。……