甄军丽,王维平

在众多癫痫模型中,点燃癫痫模型类似临床患病的癫痫发作,是人们最为感兴趣的癫痫模型之一,其中戊四氮腹腔注射所致SD大鼠慢性点燃模型较为常见,而对槐定碱致痫模型较少报道。本实验应用大剂量槐定碱致痫,观察大鼠脑内Caspase3及热休克蛋白-70(hsp-70)含量的变化,探讨细辛脑注射液对致痫大鼠抗癫痫的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Sprague-Dawley(SD)大鼠42只,雄性,体重

180 g±20 g,SPF级,由河北医科大学实验动物中心提供,实验动物批准号:DK0505-0158。

1.2 药物、试剂与仪器 槐定碱(sophoridine,SR)由宁夏药物研究所提供,批号:991230;细辛脑注射液,购于桂林南药股份有限公司,国药准字H45021202;卡马西平由上海第六制药厂提供;一抗购于santa cruz biotechnology;二抗由中杉生物工程有限公司提供;冰冻切片机(德国 LEICA RM-2135);研究用生物显微镜(日本OLYM PUS BX60);CMIAS系列数码医学图像分析系统(中国M otic Med 6.0);染色剂甲苯胺蓝(购于上海生化试剂有限公司)。

1.3 方法 42只大鼠随机均分为6组,每组7只,分别为空白组、模型组、卡马西平对照组、细辛脑高剂量组、细辛脑中剂量组、细辛脑低剂量组。其中空白组、模型组予饲双蒸水2 mL/d,卡马西平对照组给予卡马西平10 mg/(kg◦d),细辛脑组高、中、低剂量组浓度按9 mg/kg、5 mg/kg、2 mg/kg配制,分别饲药10 d。第11天除空白组外均予槐定碱11 mg/kg腹腔注射,对大鼠进行行为学观察,于 24 h后腹腔注射10%水合氯醛麻醉,开胸暴露心脏,升主动脉插管,以生理盐水250 mL和4%多聚甲醛固定30 min后,迅速取出全脑,沿脑正中矢状切开,取大脑于相同固定液中固定24 h(4℃),次日以30 μ m 厚度进行冰冻切片,行连续冠状切片,一半用于检测皮质和海马的Caspase3及 hsp-70表达情况;另一半行 Nissle染色,中性树胶封片,高倍镜(X400倍)下观察。

1.4 观察项目 参考Racine癫痫发作分级标准观察大鼠癫痫发作分级并记录;行脑组织Nissle染色法,观察皮质和海马的神经元丢失或坏死情况;运用CMIAS系列数码医学图像与分析系统记录各组Caspase3及hsp-70阳性细胞密度。

1.5 大鼠惊厥发作评分标准 参考Racine癫痫发作分级标准,0级:无反应;Ⅰ级:节律性嘴和面部抽动或洗脸;Ⅱ级:点头或甩尾;Ⅲ级:单肢抽动;Ⅳ级:多肢抽动和强直;Ⅴ级:全面性强直阵挛发作。

1.6 统计学处理 运用SPSS 13.0软件处理数据结果,采用Ridit、方差分析。

2 结 果

2.1 大鼠行为学观察(见表 1)

表1 各组大鼠腹腔注射槐定碱后癫痫发作情况 只

2.2 脑组织形态学变化 Nissle染色结果显示,细辛脑中、高剂量组、空白组和卡马西平对照组脑组织几乎呈均匀一致的紫蓝色,细胞密度大,神经元形态结构完整,为三角形、长条形或多边形,胞浆染色清晰,尼氏体着蓝色,胞核淡然,海马 CA1区锥体细胞3层～4层,形态规则,未见明显神经元丢失;槐定碱模型组可见神经元皱缩体积缩小,与周围组织有脱离,胞核深染,有核分裂及核溶解,具有凋亡的特征,多数胞浆呈空泡状,海马CA1区细胞排列散乱,无层次感,尼氏体减少,部分神经元丢失,细胞密度小;细辛脑小剂量组可见较多神经元肿胀,少量神经元皱缩,胞核深浅不均,细胞密度较大,与模型组比较,神经元损伤减轻、丢失减少,提示细辛脑治疗组对癫痫后神经元损伤具有一定的保护作用。

2.3 Caspase3及hsp-70含量(见表 2)

表2 各组Caspase3及hsp-70阳性细胞(±s)/100 g

表2 各组Caspase3及hsp-70阳性细胞(±s)/100 g

组别 n Casepase3 hsp-70空白组 7 5.94±2.13 1.39±1.22模型组 7 23.04±2.26 18.77±2.24卡马西平对照组 7 15.83±2.891) 7.39±1.691)细辛脑低剂量组 7 13.46±3.011) 6.07±2.051)细辛脑中剂量组 7 9.86±2.781) 5.54±1.381)细辛脑高剂量组 7 7.98±2.761) 2.49±1.571)与模型组比较,1)P＜0.05

3 讨 论

癫痫的病因病机十分复杂,中医学认为,本病多由先天禀赋受损,气血瘀滞,或惊恐劳伤过度,肝、脾、肾三脏功能失调,使痰壅风动,上扰清窍而发病。发病初期多正盛邪实,日久必损伤正气,痰浊、瘀血等邪实沉痼,形成虚实夹杂。因“壮火食气”亦可导致气虚;肝风痰浊日久亦可出现木旺克脾土,致脾虚水湿失运,痰浊内生,脾虚痰盛日久,气血生化乏源则可致心血不足,中焦气机失运;又因“精血同源”,日久必累及肝肾之阴精而成肝肾阴虚证。可见本病病变脏腑以心肝脾肾为主,病理特点为本虚标实、虚实夹杂。治疗大法当以扶正祛邪,标本兼顾。本品是中药石菖蒲的主要有效成分,临床上常用于成人和儿童细菌性肺炎、肺内感染、急慢性支气管炎、支气管哮喘、阻塞性肺气肿、肺心病、支气管扩张及支气管肺癌以及感冒引起的咳嗽、咯痰、喘息。最新研究认为本品对癫痫发作有显著疗效,其可能的机制是:α细辛脑能提高大脑皮层的点刺激阈,抑制电刺激的突触传导及痫性放电。以石菖蒲为君药,祛痰浊风邪,兼具开窍启闭、祛风止痉之功效。

本实验选择了大剂量槐定碱(11 mg/kg)制作大鼠癫痫模型,可使神经元过度兴奋,引起动物Ⅲ级及以上癫痫发作,且发作频繁,可持续0.5 h以上。这个模型类似于癫痫部分性发作。张琳娜等[1]实验表明,槐定碱2.94 mg/kg可明显抑制青霉素致痫大鼠皮层癫痫样放电,使潜伏期明显延长,改善神经元细胞损伤和清除氧自由基,具有一定的抗癫痫作用,而槐定碱5.88 mg/kg和11.76 mg/kg却可加强痫样发作。提示槐定碱可能具有双向调节性,对于不同剂量槐定碱对中枢活动的不同影响和作用机制还有待于进一步研究。

Caspase家族目前已发现 14个成员,其核心成员为Caspase3。该蛋白酶于1994年由Fernandes从人T细胞系首次克隆,因编码相对分子质量为32×103的半胱氨酸蛋白酶又称CPP32[2]。结构分析发现人类Caspase3全长氨基酸序列与介导线虫凋亡的Ced3蛋白的相似性最高,被认为是Ced3在哺乳动物中真正的对应者。Caspase3所作用的底物多为维持细胞生命活动的重要功能蛋白,分别参与DNA修复、mRNA裂解和细胞骨架重建。多种多样的刺激因素启动的信号激活Caspase3,引起多效基因变化,使细胞质、细胞核及细胞骨架的重要蛋白质降解失活[3,4],从而导致细胞不可逆性地走向凋亡,这为进一步研究癫痫发作与细胞凋亡的分子机制提供了实验工具和基础。Gillardon采用原位杂交检测了由海人藻酸诱发的癫痫大鼠的海马组织,发现海马组织存在Caspase3基因表达和凋亡神经元,因而推测可能是神经元癫痫样放电的兴奋性毒性导致Caspase3的激活表达和海马神经元的凋亡丢失[5]。本实验发现,癫痫样放电导致神经元凋亡丢失,Caspase3参与介导了该凋亡过程,由此设想,或许将来通过阻止Caspase3表达或抑制Caspase3活性这一策略可以挽救凋亡神经元,延缓海马硬化的进程。

而hsp-70是机体在遭受各种刺激后,诱导产生的一组应激蛋白。hsp-70是热休克蛋白(称为“分子伴侣“或”伴侣蛋白”)中最保守和最主要的一类[6],在细胞应激后生成最为显著,被认为对神经元损伤具有保护作用。当神经元受损时,hsp-70表达后分别在胞浆和胞核中同变性蛋白结合,防止变性蛋白进一步折叠,促使其恢复或加速其降解和消除,维持神经元内蛋白自稳,以维护细胞的功能和生存。目前,神经元受损时,hsp-70表达对受损神经元的保护作用已基本肯定[7],因此,hsp-70在脑内表达的速度及数量在一定程度上影响神经元对癫痫兴奋性损伤的耐受性,并可能是癫痫脑内神经元选择性脱失的内在机制之一。

本实验中细辛脑注射液对槐定碱致痫大鼠脑组织中caspase3及hsp-70的合成有明显抑制作用,能够显著控制癫痫发作,减轻神经元在癫痫发作时的兴奋性损伤。该药物对痫性发作后Caspase3及hsp-70的表达相协调,这和郑虹等[8]对两者在肿瘤方面的研究报道有些不一致,可能与癫痫发作的持续时间和程度有关。究竟凋亡和应激蛋白的表达之间是否具有相关性,具体作用机制和作用途径尚有待进一步去研究。

[1]张琳娜,陈晓霞,李玉香,等.槐定碱对青霉素致痫大鼠中枢活动的影响[J].宁夏医学院学报,2008,30(6):703-705.

[2]Fernandes AT,Litwack G,Alnemri ES.CPP32,a novel human apoptotic protein with homology to Caenorhabditis elegans cell death protein Ced-3 and mammalian interleukin-1 beta converting enzyme[J].J Biol Chem,1994,269(49):30761-30764.

[3]Song Q,Lees Miller SP,Kumar S,et al.DNA dependent protein kinasecatalytic subunit:A target for an ICE like protease in apoptosis[J].EMBOJ,1996,15(13):3238-3246.

[4]Waterhouse N,Kumar S,Song Q,et al.Heteronuclear ribonucleoproteinsC1 and C2,components of the spliceosome,are specific targets of interleukin 1 beta converting enzy me like proteases in apoptosis[J].J Biol Chem,1996,271(46):29335-29341.

[5]Gillardon F,Bottiger B,Schmitz B,et al.Activation of CPP-2 protease inhippocampal neurons following ischemia and epilepsy[J].Brain Res MolBrain Res,1997,50(1-2):16-22.

[6]周纯,黄常志.热休克蛋白70与肿瘤[J].国外医学:肿瘤学分册,1997,24(5):257.

[7]Plumeir JC.Transgenic mice expresinge human in ducilbe HSP70 have hippocampal neurons resistant to ischemic injury[J].Cell Stress Chaperones,1997,2(3):162-168.

[8]郑虹,耿明.HSP70、Caspase3在胶质细胞瘤中的表达及与肿瘤病理分级的关系[J].山东大学学报,2007,45(9):944-946.