杨 颖,白晓秋,田 源

病毒性心肌炎(VMC)发病在我国乃至世界呈上升趋势[1]。病毒性心肌炎是以心肌组织大量单核细胞浸润,出现灶性坏死及纤维化等病理改变为特征的一种病毒引起的免疫性疾病[2]。近年来,发现多种病毒可以促发心肌细胞凋亡,心肌细胞凋亡可能是病毒性心肌炎向扩张型心肌病演变的机制之一。本实验通过多次腹腔接种柯萨奇B3m病毒稀释液方式建立重复感染的VMC动物模型,通过对小鼠心肌细胞凋亡水平测定,探讨益气温阳活血化瘀方防治慢性病毒性心肌炎的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及病毒 雄性BALB/c小鼠120只,(3～4)周龄,购自北京军事医学科学院实验动物中心[动物合格证号:SCXK-(军)]。柯萨奇B3m病毒(哈尔滨医科大学克山病研究所提供),在Hela细胞中传代,冻融 3次,离心(2 000 r/min)10次,上清液分装,在Hela细胞中测50%组织感染率(TCID)为10-7,-70℃保存备用。

1.2 试验用药 益气温阳、活血化瘀方由黄芪、人参、肉桂、附子、川芎、丹参、大青叶等组成。中药经水提取,制成浸膏,含水量为21%。用蒸馏水稀释,调整浓度为82%,即相当于1 mL悬液中含生药4.3 g,由黑龙江中医药大学制剂室提供。

1.3 动物模型的复制及分组 小鼠慢性病毒性心肌炎模型的复制,分别于 1 d、8 d、15 d、22 d、36 d、50 d 6 次经小鼠腹腔接种柯萨奇B3m病毒稀释液接种病毒。空白组于实验相同时点给予同体积的RM1640液。试验分组,分别将存活慢性病毒性心肌炎小鼠120只,随机分为模型组、空白组、中药组,每组40只。

给药方法,中药组及西药组于末次病毒感染后10 d灌胃,中药组予益气温阳 、活血化瘀方混悬液10.35 g/(kg◦d)灌胃,空白组和模型组灌胃同体积生理盐水。每日1次灌胃4周。全部灌胃结束后模型组剩余33只,中药组剩余39只,空白组剩余38只。

1.4 心肌细胞凋亡检测 应用DNA原位缺口末端标记法(T UNEL)检测。石蜡组织切片经常规脱蜡脱水后,用蛋白酶K(Roche)室温孵育30 min,PBS洗片后与0.3%过氧化氢甲醇溶液室温孵育30 min,PBS冲洗2次,加入 TUNEL反应混合液在湿盒中37℃室温孵育60 min,PBS冲洗3次,苏木精复染,脱水透明,中性树胶封片。每张切片于400倍光镜下,计数呈棕黄色的T LNEL阳性细胞核以及所有细胞核。心肌细胞凋亡情况以Motic Images Aovancel 3.2图像分析系统检测的平均光密度和目标总面积占选区的百分比表示。

1.5 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件进行分析。计量资料用均数±标准差(±s)表示,多组均数间的比较应用方差分析,两两比较应用 q检验。

2 结 果

2.1 心肌组织病理形态学及超微结构的改变 大体外观小鼠心脏解剖,肉眼可见接种病毒后的两组小鼠心肌表面分布着许多灰白色点状、絮状或条状物。心肌组织病理形态学改变,空白组HE染色可见心肌纤维排列整齐,间质血管无改变,未见心肌细胞变性、坏死;VG染色可见极纤细的胶原纤维。模型组HE染色可见心肌纤维排列紊乱、断裂,心肌细胞肥大,空泡变性,血管充血出血,少量炎细胞浸润,间质纤维化明显。VG染色可见大量的胶原纤维。中药组HE染色可见心肌纤维排列紊乱较轻微,未见心肌断裂,血管充血出血,少量炎细胞浸润,间质纤维化程度轻微。VG染色可见血管间质有少量胶原纤维聚集。

心肌组织超微结构改变,空白组小鼠肌纤维走行规则,M线Z线清晰可见,线粒体结构清晰,间质血管内皮结构正常。模型组小鼠心肌细胞核变大,可见双核仁,核膜明显不规则,线粒体明显增多,线粒体嵴融合,肌丝溶解、断裂,M 线消失,间质胶原纤维增生明显,间质成纤维细胞增生活跃。中药组小鼠心肌肌纤维走行基本规则,线粒体轻度增生,间质胶原纤维增生不明显。

2.2 益气温阳,活血化瘀方对小鼠心肌细胞凋亡的影响 与空白组相比,各组小鼠心肌细胞凋亡明显升高(P＜0.05);与模型组相比,中药组心肌细胞凋亡明显受到抑制(P＜0.05)。详见表1。

表1 各组小鼠心肌细胞凋亡光密度及凋亡目标总面积占选区面积的比较(±s)

表1 各组小鼠心肌细胞凋亡光密度及凋亡目标总面积占选区面积的比较(±s)

组别 n 光密度 面积(μ m2)空白组 38 0.301 9±0.125 0 4.277 4±0.140 3模型组 33 0.373 6±0.164 21) 10.160 0±1.219 21)中药组 39 0.325 3±0.078 11)2) 6.607 6±0.195 61)2)与空白组比较,1)P＜0.05;与模型组比较,2)P＜0.05

3 讨 论

对于慢性病毒性心肌炎,目前认为它多发生在急性、重症心肌炎后,以斑痕组织为主要病理表现的心肌病变,另外病毒的持续作用及自身免疫机制引起的心肌反复损伤也可致慢性VMC。心肌细胞凋亡是慢性病毒性心肌炎心肌细胞表达凋亡的相关蛋白。在病毒性心肌炎发病过程中,多种调控细胞凋亡的基因及蛋白质分子的表达水平明显增高现象,提示在病毒性心肌炎的病理生理发展过程中,存在凋亡所造成的对心肌细胞的损伤,但凋亡的机制尚有待进一步探讨。通过抑制心肌细胞凋亡,减少心肌细胞坏死。随病程的迁延心肌细胞凋亡呈现增加趋势,在慢性VMC,发生明显心肌细胞凋亡现象。目前研究表明在心血管疾病的发生发展过程中,细胞凋亡起重要的作用。细胞不断凋亡,导致心肌细胞不断丢失,最终导致心功能障碍的重要因素。

本实验用DNA原位缺口末端标记法观察心肌细胞的病理变化及心肌细胞凋亡情况,结果发现正常对照组未见凋亡心肌细胞,模型对照组心肌细胞凋亡显著增加,表明细胞凋亡参与了慢性VMC的发生发展过程,中药组心肌细胞凋亡明显减少。凋亡的心肌细胞多呈散在分布,非坏死区域也发现单个心肌细胞凋亡。本实验观察益气温阳,活血化瘀方对慢性期VMC小鼠心肌细胞凋亡的影响,结果显示,模型组心肌细胞凋亡明显高于空白组(P＜0.05),中药组心肌细胞凋亡较对照组明显降低(P＜0.05),说明益气温阳,活血化瘀方具有抑制心肌细胞凋亡的作用。

[1]胡大一,许玉韵.循证心血管病学[M].北京:人民军医出版社,1995:5.