邓小芸，祁小乐，高玉龙，高宏雷，秦立廷，高 立，王永强，王笑梅*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室，黑龙江 哈尔滨 150001；2.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030；3.黑龙江畜牧兽医职业学院，黑龙江 双城 150111)

网状内皮组织增生病(Reticuloendotheliosis，RE)是由RE病毒(REV)引起的禽类以急性网状细胞肿瘤形成、矮小综合征、淋巴组织和其它组织的慢性肿瘤形成为特征的一群病理综合症[1]。REV感染不仅能引起肿瘤，还可引起感染鸡胸腺、法氏囊等免疫器官萎缩，造成感染鸡的免疫功能下降、甚至丧失，导致免疫抑制，使感染鸡极易继发感染其他病毒病和细菌病。

REV属于γ反转录病毒属，有囊膜，基因组为单链正义RNA。非缺陷型病毒基因组长约8.2 nt，缺陷型病毒长约5.7 nt。REV基因组含有两个开放阅读框(ORF)，编码3个蛋白(gag、pol和env)，两侧为长末端序列(Long terminal region，LTR)[2]。

1 材料和方法

1.1 病毒株、细胞、载体和菌种 REV HLJR0901株由哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病课题组从黑龙江省分离并鉴定；pMD18-T载体购自TaKaRa公司；HLJR0901的全基因组分别分段克隆于6个重组质粒中[12]，依次为pT-F1、pT-F2、pT-F3、pT-F4、pT-F5、pT-F6，pBluescriptⅡ KS(+)载体、Top10F'菌种由本课题组保存。

1.2 主要试剂 PrimeSTARTMHS DNA Polymerase、dNTP等购自TaKaRa公司；限制性内切酶DpnⅠ购自NEB公司；Plasmid Midi Kit购自QIAGEN公司；LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；Opti-MEM I Medium购自GIBCO公司；FITC标记的抗鸡IgG购自Sigma公司；鸡抗REV多克隆抗体购自美国Charles River公司。

1.3 引物设计 用于全基因组的各片段扩增及基因组拼接的引物见表1。另外，用于基因组分子标签引入的引物为：RevC2250GU：5'-ACTCAGAAGAT GGCgAAGGTACTACTCGC-3'和 RevC2250GL：5'-G CGAGTAGTACCTTcGCCATCTTCTGAGT-3'(小写字母代表突变的核苷酸)。引物由英俊生物技术有限公司(Invitrogen)合成。

表1 扩增REV前病毒基因组(pre-DNA)所用引物Table 1 Primers used for REV pre-DNA amplification

1.4 HLJR0901全基因组的拼接及分子标签的引入利用相应引物，分别从重组质粒pT-F1、pT-F2、pT-F3、pT-F4、pT-F5、pT-F6中扩增出6个连续且部分重叠的HLJR0901基因组片段，分别命名为F1～F6。用重叠延伸PCR(SOE PCR)技术将 F1、F2和F5拼接起来，具体步骤如下：先用F5上游引物和F1下游引物通过SOE PCR获得片段F51，然后再用F5上游引物和F2下游引物将F51和F2拼接为 F512(基因组 1 bp～4546 bp)，将其克隆于pMD18-T载体中，获得重组质粒pT-F512。采用同样的技术用相应引物将F2、F3、F4和F6逐步融合拼接为F2346(基因组2368 bp～8284 bp)，将其克隆于pMD18-T载体中，获得重组质粒pT-F512，然后将其亚克隆于pBluescriptⅡKS(+)载体中，获得重组载体pBlu-F236。

以pT-F512为模板，用PrimeSTARTMHS DNA Polymerase通过PCR的方法在HLJR0901基因组上引入无意义突变C2250G作为分子标签，所用引物为RevC2250GU和 RevC2250GL。然后用 DpnⅠ降解PCR产物中被甲基化模板pT-F512，将处理过的PCR产物转化感受态细胞Top10F'，提取并筛选阳性质粒，命名为pT-mF512。重组质粒由英俊生物技术有限公司测序。

1.5 HLJR0901感染性分子克隆的构建 用EcoRⅠ和SphⅠ将mF512从pT-mF512切下，克隆于经同样酶切处理的pBlu-F236，获得含有带分子标签的HLJR0901全基因组的重组质粒pBlu-mHLJR0901。经EcoRⅠ酶切鉴定为阳性的重组质粒由英俊生物技术有限公司测序。

1.6 重组质粒pBlu-mHLJR0901转染及病毒拯救用QIAGEN Plasmid Midi Kits制备纯化pBlu-mHLJR 0901。由 LipofectamineTM2000介导转染约 60%单层的鸡胚成纤维细胞(CEF)细胞。同时以正常CEF为对照。转染后6 h弃细胞上清，用Hanks液洗细胞3次，加入2 mL DMEM(含10%PAA胎牛血清和100 u/mL双抗)置37℃CO2继续培养。转染后7 d收获病毒，反复冻融3次后连续在CEF中传代。经鉴定后将拯救的病毒命名为rHLJR0901。

1.7 病毒粒子鉴定

此类影响主要指的为寄生虫、病媒昆虫的生长由于受到外界气候变化的影响而对牛羊疾病的造成的影响。牛羊寄生虫病的出现、传播等受其生长、发育环境的气候条件的影响较大，且具有显著的地域性以及季节性特点。具体而言：基于温度的提升或者降水量的增加，寄生虫的繁殖速度越来越快，这就导致牛羊相关疾病的可能性大幅度提升，包括单一寄生虫感染类疾病和多种寄生虫混合感染类疾病。我国的西北区域多为放牧地带，于降雨量较多的时节，该区域的寄生虫数量会大幅度增加，同时，牛羊患寄生虫病的概率也会随之提升。

1.7.1 间接免疫荧光 将拯救的第5代病毒按常法接种于约60%单层的CEF 96孔板中，7 d后按常规方法进行间接免疫荧光检测。一抗为鸡抗REV多克隆抗体，二抗为FITC标记的抗鸡IgG。同时设不接种病毒细胞对照。

1.7.2 PCR及分子标签鉴定 取CEF细胞培养的病毒悬液200 μL，分别加蛋白酶K和SDS至终浓度为100 mg/L和0.5%，56℃消化3 h～4 h；分别用苯酚/氯仿按常规方法抽提，提取DNA，以其为模板进行PCR扩增REV的F1片段。将PCR产物克隆于pMD18-T中，由英俊生物技术公司测序。

1.7.3 电镜检查 病毒感染CEF细胞后第7 d，取感染细胞，用PBS离心洗涤，将沉淀用固定液固定，制作超薄切片进行电镜观察。

1.8 拯救的REV复制动力学比较 用Hank's液将第5代病毒液10倍递次稀释为10-1～10-55个稀释度，分别接种于CEF，每个稀释度做8个重复，培养7 d后，做间接免疫荧光检测，按Reed-Muench法计算rHLJR0901的组织半数感染量(TCID50)。以104TCID50病毒接种单层的CEF(约106个细胞)，感染后3 d、5 d、7 d分别取细胞上清，滴定其TCID50效价。重复测定3次，取其平均值，绘制病毒复制动力学曲线。同时设亲本毒对照。

2 结果

2.1 HLJR0901感染性分子克隆的构建 以6个分别含有REV不同片段的重组质粒为模板，通过SOE PCR将HLJR0901全基因组克隆于pBluescriptⅡ中，并经点突变(C2250G)构建了具有分子标签REV感染性质粒pBlu-mHLJR0901。EcoRⅠ酶切鉴定pBlu-mHLJR0901大小约 11000 bp(图 1)；pBlumHLJR0901的测序结果显示，其全基因组核酸序列(除C2250G点突变外)与亲本病毒HLJR0901的序列一致；同时显示，C2250G经人工点突变消除了原有的MscⅠ限制性内切酶酶位点，可以作为鉴别亲本病毒的分子标签。

图1 pBlu-mHLJR0901的酶切鉴定Fig.1 Identification of pBlu-mHLJR0901 by restriction enzyme digestion

2.2 REV的拯救 将pBlu-mHLJR0901转染CEF，由于REV不引起细胞病变(CPE)，每隔7 d传代，共传3代～5代。对盲传的细胞转染物进行鉴定，确定是否获得拯救病毒。

2.3 拯救的病毒粒子鉴定

2.3.1 间接免疫荧光 重组质粒转染CEF细胞以及盲传过程中，均没有出现CPE。鸡抗REV多克隆抗体介导的间接免疫荧光检测拯救的盲传第5代病毒，可观察到绿色特异性荧光，而正常细胞对照未观察到荧光(图2)。

2.3.2 PCR及分子标签测定 以拯救的REV第5代总细胞DNA为模板进行PCR扩增得到了预期的约1800 bp的片段(图略)。测序结果显示，分子标签(C2250G)存在(图 3)。

2.3.3 电镜检查 电镜下可观察到rHLJR0901细胞培养物中存在直径80 nm～100 nm有囊膜的病毒粒子(图4)，与REV的形态结构一致。而未接毒细胞对照在电镜下没有观察到病毒粒子。

2.4 拯救的REV复制动力学 复制动力学曲线显示，拯救的REV rHLJR0901与亲本毒HLJR0901在CEF细胞上具有相似的复制特性，接毒后7 d的病毒效价可达105TCID50/mL以上，两者之间无显著性差异(图 5)。

3 讨 论

本研究采用SOE PCR的方法将我国东北REV分离株HLJR0901全基因组拼接，构建了感染性克隆 pBlue-mHLJR0901，转染 CEF获得拯救病毒。REV属于反转录病毒，前病毒全基因组克隆被转染于CEF后，即可利用宿主细胞的RNA聚合酶Ⅱ，启动转录、翻译过程，并最终完成病毒的包装和释放。所以在设计REV感染性克隆时，不用额外考虑启动子和核酶序列等修饰因子。为鉴别拯救的REV和野毒，本研究采用定点突变的方法在基因组中引入了单点突变C2250G作为分子标签，该突变将MscⅠ限制性酶切位点(TGGCCA)突变消除。经序列分析，HLJR0901株及其它REV毒株如：APC-566(DQ387450)、HA9901(AY842951)、HLJ07I(GQ375848)、3122/03(DQ513316)、3295/04(DQ513317)、chicken/3337/05(FJ439120)、goose/3410/06(FJ439119)、PCR92(DQ237901)、FA(AF246698)、SNV(DQ003591)等在该位置均存在MscⅠ限制性酶切位点(TGGCGA)，而本实验拯救的毒株rHLJR0901无此位点。

影响病毒拯救效率的因素是多方面的。首先，为保证转染用的质粒质量，最好选用转染级别的质粒提取试剂盒。本研究选用QIAGEN公司的Plasmid Midi Kit，所提质粒超螺旋占多数，转染效率100%，远高于其他方法提取的质粒；第二是转染方法，常见的转染DNA的方法有脂质体法、磷酸钙法、电击法等，不同的系统可能适用不同的方法。本研究采用的转染试剂是LipofectamineTM2000。本研究建立REV反向遗传操作系统稳定性良好，在CEF细胞中进行了3批12次转染，均成功拯救出病毒。

据报道，REV有望用做将外源基因导入鸡和哺乳动物细胞内的载体[13]，这类载体在转基因鸡和人的基因治疗方面具有良好的应用前景。因此，可以利用反向遗传操作系统将REV感染性克隆改造成为一种病毒载体，在基因治疗等方面发挥作用。另外，本研究建立的REV国内流行毒株的反向遗传操作系统，具有简便、高效、稳定性好等特点，为深入开展REV基因功能等研究奠定了基础。

[1]Witter R L,Johnson D C.Epidemiology of reticuloendotheliosis virus in broiler breeder flocks[J].Avian Dis,1985,29(4):1140-1154.

[2]Barbosa T,Zavala G,Cheng S,et al.Full genome sequence and some biological properties of reticuloendotheliosis virus strain APC-566 isolated from endangered Attwater's prairie chickens[J].Virus Res,2007,124(1-2):68-77.

[3]Cheng W H,Huang Y P,Wang C H.Serological and virological surveys of reticuloendotheliosis in chickens in Taiwan[J].J Vet Med Sci,2006,68(12):1315-1320.

[4]Cui Z,Sun S,Zhang Z,et al.Simultaneous endemic infections with subgroup J avian leukosis virus and reticuloendotheliosis virus in commercial and local breeds of chickens[J].Avian Pathol,2009,38(6):443-448.

[5]崔治中，杜岩.禽网状内皮增生病病毒感染和鸡群的免疫抑制[J].中国兽药杂志，2000，34(4)：l-3.

[6]金文杰，崔治中，刘岳龙，等.传染性法氏囊病病料中MDV、CAV、REV的共感染检测[J].中国兽医学报，2001，1：6-9.

[7]秦立廷，高玉龙，潘伟，等.我国部分地区蛋鸡群ALV-J及与REV、MDV、CAV混合感染检测[J].中国预防兽医学报，2010，32(2)：90-93.

[8]Cui Z,Zhuang G,Xu X,et al.Molecular and biological characterization of a Marek's disease virus field strain with reticuloendotheliosis virus LTR insert[J].Virus Gene,2010,40(2)：437-446.

[9]Liu Q,Zhao J,Su J,et al.Full genome sequences of two reticuloendotheliosis viruses contaminating commercial vaccines[J].Avian Dis,2009,53(3):341-346.

[10]吉荣，崔志中，王锡乐，等.分子克隆化禽网状内皮组织增生症病毒传染性及其前病毒全基因组序列研究[J].病毒学报，2005，21(6)：448-455.

[11]王玉，崔志中，姜世金.网状内皮组织增生症病毒中国分离株HA9901全基因组核苷酸序列的测定与分析[J].中国科学C 辑，2006，49(2)：149-157.

[12]邓小芸，祁小乐，高宏雷，等.网状内皮组织增生病病毒HLJR0901株全基因组的克隆及序列分析[J].中国兽医科学，2010，40(6)：441-447.

[13]Robert A B,Hsu R Y,Boggs T.Replication-defective vectors of reticuloendotheliosis virus transduce exogenous genes into somatic stem cells of the unincubated chicken embryo[J].J Virol,1989,63(6):2680-2689.