陈 静，李里特

(1.北京物资学院物流学院，北京 101149；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

豆豉水提物对α-葡萄糖苷酶体外抑制活性影响

陈 静1，李里特2

(1.北京物资学院物流学院，北京 101149；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

本研究收集全国各地的37种豆豉样品，测试其水提物对α-葡萄糖苷酶体外抑制活性。结果表明：37种来源不同的豆豉样品水提物均对小鼠肠道内的α-葡萄糖苷酶呈现一定程度的抑制活性，其中5#(L.Y)、16# (W.N.H)以及21#(M.W)豆豉水提物对α-葡萄糖苷酶呈现较高的抑制活性(P＜0.05)；此外，通过对高活性豆豉的蔗糖和葡萄糖含量检测，结果表明，尽管豆豉中含有微量的葡萄糖，但抑制干扰作用甚微。本研究结果预示着豆豉中存在可以强烈抑制α-葡萄糖苷酶的活性成分，这种活性成分呈现较好的水溶性，可能是具有类似糖结构的成分在起作用，有待于深入研究。

豆豉；水提物；α-葡萄糖苷酶抑制；活性成分

现代研究表明，发酵大豆制品中有着丰富的生物活性物质，各种生物活性物质各自或相互协同作用，构成了大豆发酵食品独特的生理功能，如抗过敏、抗癌、溶血栓、抗氧化[1]、降血压[2-3]和抗菌等[4]。但是针对发酵大豆食品的降血糖活性研究的相关报道所见甚少。Fujita等[5]发现让边缘糖尿病人和症状较轻的糖尿病人每天服用0.9g豆豉提取物，连续服用6个月，平均血糖值由(9.31±0.070)mmol/L降低到(8.61±0.66)mmol/L，且无一例副作用出现；随后2005年他们后续研究报道了豆豉水提物对血脂的影响，让非糖尿病人和小鼠每顿餐前食入0.3g豆豉提取物，结果显示在受试者体内三酸甘油酯水平明显降低，因此也确定了豆豉可长期用来治疗糖尿病[6]，但并未对其中降血糖成分进行分析、鉴定。我国作为豆豉生产的起源国，有着十分宝贵、分布广泛的豆豉资源，然而在这方面的研究开展较少。

本实验中收集了来源于全国各地的37种豆豉样品，其中南方地区的样品分别来源于两广及云南地区；中部地区的样品主要采集于湖南、江西及重庆等地；中西部则主要采样于四川盆地一带，四川是我国豆豉食用最为广泛的地区；北部地区样品主要来源东北及陕西一带。这些豆豉样品几乎遍布了中国各地，因此在一定程度上可以代表中国的传统发酵豆豉。从这些豆豉中提取降血糖活性成分，进行体外α-葡萄糖苷酶抑制活性评价，深入分析豆豉α-葡萄糖苷酶抑制活性与内在成分之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

实验中所用样品均购买于全国各地不同地区的超市、农贸市场，其中一些自制样品是采样于当地农户家中，豆豉样品具体品牌、产地及感官状态见表1。

4-硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷(4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside)、小鼠肠道丙酮提取粉(intestinal acetone powders of rat) 美国Sigma 公司；蔗糖、葡萄糖测定试剂盒(10 139 041 035) 美国Roche公司；以上均为分析纯。

FDU-540真空冷冻干燥机 日本东京理化公司；Model 550酶标仪 美国Bio-Rad公司日本东京实验室；FW 177中草药粉碎机 中国天津泰斯特仪器有限公司；TS5BS4高速均质机 德国IKA labortechnik公司；MS-8496F 96微孔板(0.4mL×96) 日本住友电木有限公司；Millx-HV微孔过滤器 日本Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 豆豉样品水提物的制备

取各种市售豆豉样品置于真空冷冻干燥机中冻干，在中草药粉碎机中磨成粉末状，粒度大于6目，然后精确称取豆豉冻干粉1.000g，置于50.0mL离心管中，加入10.0mL蒸馏水溶解，在均质机中高速均质(20000r/min，5min)，然后使用超声波提取(100W，30min)，取出离心(3700r/min，10min)，取其上清液使用0.45μm 微孔过滤膜过滤，收集过滤液即得豆豉水提物。

1.2.2 豆豉样品水提物α-葡萄糖苷酶抑制实验

本研究中所使用的α-葡萄糖苷酶体外抑制实验方法是本课题组针对豆豉样品颜色较深的特殊性，参考传统方法并进行部分改进[7]，与传统实验方法相比，此法更适合于一些深颜色样品的活性检测。

磷酸盐缓冲液(0.5mol/L，pH6.7)：称取NaH2PO4· 2H2O 3.365g，Na2HPO4·12H2O 10.182g，定容到1000mL，调节pH6.7，储存在4℃冰箱。

底物：4-硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷(4-NPG)，质量浓度0.9133mg/mL，溶解于磷酸盐缓冲液(0.5mol/L，pH6.7)中，漩涡混合均匀。

α-葡萄糖苷酶：小鼠丙酮提取物配成质量浓度为25mg/mL，溶解于磷酸盐缓冲液(0.5mol/L，pH6.7)中，漩涡混合均匀，高速离心(9000r/min，15min)，取其上清液待用。

终止液：Na2CO3，71.389mg/mL，溶解在蒸馏水中。

将豆豉水提物在96孔板中加入蒸馏水倍比稀释，稀释到2、4、8、16、32、64、128倍，准备待测。首先在96孔酶标板内加入120μL的磷酸盐缓冲液(0.5mol/L，pH 6.7)，然后加入20μL样品，在阳性和阴性对照孔里以20μL磷酸盐缓冲液(0.5mol/L，pH6.7)代替。然后在样品孔和阳性对照孔里加入50μL α-葡萄糖苷酶溶液，在样品对照孔和阴性孔中加入50μL磷酸盐缓冲液(0.5mol/L，pH6.7)代替，在微孔板振荡器上混合均匀。最后在所有的微孔中注入50μL的4-NPG溶液，再次振荡混合均匀，在37℃培养箱保温40～50min。最终

以50μL的Na2CO3溶液的加入终止反应。使用酶标仪在405nm波长处测定吸光度。最终以样品的梯度质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制回归直线，求其斜率Ki值，Ki值越大，表示样品抑制活性越强。

表1 豆豉、大酱样品名称、产地及感官特性Table 1 Production origins, names and sensory properties of Douchi and miso samples

1.2.3 豆豉水提物中蔗糖和葡萄糖含量的测定

使用蔗糖和D-葡萄糖紫外检测试剂盒检测豆豉中的蔗糖和葡萄糖。

1.2.4 数据统计分析

采用SPSS 10.0统计软件对所得数据进行One-Way ANOVA分析，使用S-N-K检验方法进行数据分析检验，在P＜0.05水平数据之间差异显著。

2 结果与分析

2.1 豆豉水提物对小鼠肠道内的α-葡萄糖苷酶抑制活性影响

图1 各种市售豆豉水提物对α- 葡萄糖苷酶抑制活性的影响Fig.1 Anti-α- glucosidase activity of water-extract from vraious commmercial Douchi samples

全国各种市售豆豉样品水提物的α-葡萄糖苷酶抑制实验结果如图1所示。通过对收集到的37种来源不同的豆豉样品进行体外抑制实验，结果显示我国大部分豆豉样品水提物均对小鼠肠道内的α-葡萄糖苷酶呈现一定程度的抑制活性。根据α-葡萄糖苷酶体外抑制实验方法分析，所得到的抑制斜率值(Ki)越高，表明样品的抑制活性越强。因此纵观各种豆豉样品对α-葡萄糖苷酶抑制活性图可以看出，我国传统发酵所制的豆豉对α-葡萄糖苷酶的确存在着抑制作用。

SPSS统计结果显示5#(L.Y)、16#(W.N.H)以及21# (M.W)豆豉样品的水提物对α-葡萄糖苷酶具有较高的酶抑制活性，其抑制斜率值(Ki)显著高于其他样品(P＜0.05)，其他品牌的豆豉样品呈现一个相对次低或较低的抑制活性。就豆豉生产的区域角度分析，3种具有高α-葡萄糖苷酶抑制活性的豆豉来源产地不同，5#(L.Y)豆豉来源于湖南浏阳地区，16#(W.N.H)豆豉来源于四川地区，而21#(M.W)豆豉则源产于江西。豆豉在我国的南方以及中部地区食用广泛，且生产厂家较多，并且许多农户自己制作豆豉食用，因此在加工工艺上存在着一定的差异以及不稳定性。此外从豆豉样品中微生物的角度而言，5#(L.Y)豆豉源自湖南地区，而这一地区的传统发酵的豆豉主要以曲霉型为主，16#(W.N.H)豆豉和21#(M.W)豆豉则均为毛霉型豆豉，因此就本实验筛选到的3种高活性的豆豉样品而言，其体外抑制活性强弱并不是关键取决于某种或某类微生物的存在与否；另外从感官角度分析，针对豆豉样品的颜色而言，5#(L.Y)豆豉、16# (W.N.H)豆豉样品的外观颜色为黑色，21#(M.W)豆豉样品的颜色为棕黄色，表明豆豉颜色深浅与其α-葡萄糖苷酶抑制活性强弱无直接关系。但是不同的豆豉样品又的确存在着α-葡萄糖苷酶抑制能力的差异，那么差异产生的原因可能在于豆豉样品生产厂家的加工工艺的区别，因此发酵温度、大豆品种、蒸煮条件、处理工艺以及发酵时间等工艺条件的不同都有可能是导致豆豉样品α-葡萄糖苷酶抑制活性不同的因素。

综上所述，尽管由于不同豆豉样品的加工工艺不同而导致了豆豉样品对α-葡萄糖苷酶抑制活性的强弱不同，但可以明确的是我国传统发酵的豆豉样品的确具有显著抑制小鼠肠道内α-葡萄糖苷酶的作用，预示着我国传统发酵豆豉具有潜在的降血糖活性。

2.2 豆豉水提物中蔗糖和葡萄糖的含量

表2 豆豉中蔗糖和葡萄糖的含量Table 2 Contents of sucrose and glucose in Douchi samples g/100g

豆豉水提物中葡萄糖和蔗糖含量检测如表2所示。由于在α-葡萄糖苷酶体外抑制实验中，蔗糖和葡萄糖会产生一定的干扰作用，使得所测定的结果偏高；同时豆豉作为潜在降糖食品，对明确其中葡萄糖以及蔗糖的含量也是十分必要的。实验结果表明，部分豆豉样品中的确含有一定量的葡萄糖和蔗糖，含量维持在1.88%以下。对于筛选得到3种具有高抑制活性的豆豉样品(5#、16#和21#)，在实验的检测范围内并没有检测到

蔗糖的存在，但有微量的葡萄糖存在，16#(W.N.H)样品中含有1.88%的葡萄糖，21#(M.W)豆豉中含有0.153%的葡萄糖，而5#(L.Y)未检到葡萄糖。与此同时配制相同浓度的葡萄糖标准品溶液，检测其体外α-葡萄糖苷酶抑制活性，结果显示其抑制活性仅在5%～8%，而豆豉样品水提物的抑制活性可以达到60%左右。因此本实验结果表明尽管豆豉中有微量的葡萄糖存在，但所起的抑制作用甚微，因此对豆豉样品抑制活性检测结果影响不大，同时也预示着豆豉中还存在着其他可以强烈抑制α-葡萄糖苷酶的活性成分，这种成分呈现较强的水溶性，而且可能具有类似糖结构。

3 结 论

37种来源不同的豆豉样品的水提物均对小鼠肠道内的α-葡萄糖苷酶均呈现一定程度的抑制活性，其中5# (L.Y)、16#(W.N.H)以及21#(M.W)水提物对α-葡萄糖苷酶具有较高的酶抑制活性(P＜0.05)；通过对高活性豆豉的蔗糖和葡萄糖的检测，结果表明尽管豆豉中含有微量的葡萄糖，但抑制干扰作用甚微；通过本实验的研究预示着豆豉中存在可以强烈抑制α-葡萄糖苷酶的活性成分，这种活性成分呈现较好的水溶性，可能是具有类似糖结构的成分在起作用，有待于继续深入研究。

[1] 何健, 黄占旺, 吴进菊, 等. 曲霉型豆豉类黑精的抗氧化活性研究[J].江西农业大学学报, 2006(5): 777-779.

[2] ZHANG Jianhua, TATSUMI E, DING Changhe, et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides in douchi, a Chinese traditional fermented soybean product[J]. Food Chemistry, 2006, 98(3): 551-557.

[3] FAN J F, MASAYOSHI S, EIZO T, et al. Preparation of angiotension I-converting enzyme inhibitory peptides from soybean protein enzymatic hydrolysis[J]. Food Science and Technology Research, 2003, 9(3): 254-256.

[4] LI Lite, YIN Lijun, ZHANG Jianhua, et al. Functionalities of traditional foods in China[C]//9th JIRCAS International Symposium 2002-Value-,Addition to Agricultural Products . Tsuku,ba: [出版者不详], 2002: 140-144.

[5] FUJITA H, YAMAGAMI T, OHSHIMA K. Efficacy and safety of Touchi extract, an α-glucosiadse inhibitor derived from fermented soybeans, in non-insulin-sependent diabetic mellitus[J]. Journal of Nutrition Biochemistry, 2001, 12(6): 351-356.

[6] FUJITA H,YAMAGAMI T, OHSHIMA K. Long-term ingestion of Touchi-extract, an α-glucosidase inhibitor, by boderline and mild type-2 diabetic subjects is safe and significantly reduces blood glucose levels [J]. Nutrition Research, 2003, 23(6): 713-722.

[7] KIM J S. Inhibition of alpha-glucosidase and amylase by luteolin, a flavonoid[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2000, 64(11): 2458-2463.

in vitro Inhibitory Effect of Water Extract from Douchi on Alpha-glucosidase Activity

CHEN Jing1，LI Li-te2
(1. Logistics School, Beijing Wuzi University, Beijing 101149, China；2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Thirty-seven Douchi samples collected from various regions of China were tested for the inhibitory effects of their water extracts on alpha-glucosidase in vitro. The water extracts from all these Douchi samples could inhibit mouse intestinal alpha-glucosidase to a certainty extent. In addition, samples NO.5 (L.Y), NO.16 (W.N.H) and NO.21 (M.W) showed stronger inhibitory effect against the enzyme (P ＜ 0.05). Moreover, microamounts of glucose existing in Douchi samples had less interrupting effect on the anti-hyperglycemic activity of Douchi water extract. This study suggests that there are some active components in Douchi, which can strongly inhibit alpha-glucosidase and present excellent water solubility. These components may have sacchride-like structures. However, this needs to be deeply investigated.

Douchi；water extract；alpha-glucosidase；active components

TS214.9

A

1002-6630(2010)17-0064-04

2010-01-07

陈静(1978—)，女，讲师，博士，研究方向为食品科学及生物技术。E-mail：chenjingsusan@126.com