周先汉，程丽梅，曾庆梅，张 安，宋俊骅，周典飞

(1.合肥工业大学 农产品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009；2.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009)

超临界CO2杀菌过程中萃取机制研究

周先汉1,2，程丽梅2，曾庆梅1，张 安2，宋俊骅2，周典飞2

(1.合肥工业大学 农产品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009；2.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009)

在相同工艺条件下对大肠杆菌菌悬液作超临界CO2处理，对不同时间段萃取液的成分进行分析。结果表明，萃取物主要有两大类：非极性脂肪酸类及极性较弱的小分子氨基酸类物质，均为细胞的功能性物质。证实在超临界CO2杀菌过程中确实发生了萃取作用。

超临界CO2；萃取；杀菌机理；大肠杆菌

与热杀菌、化学药物杀菌等传统杀菌技术相比，超临界CO2杀菌很少导致营养物质的损失及产生煮熟味，较好解决了杀菌过程中营养成分过多损失及色香味严重劣化等问题；与超高压等新兴的杀菌技术相比，具有成本低、节约能源、节省空间、连续生产等优点。

超临界CO2杀菌技术由Fraser于1951年发现[1]，限于当时的条件，杀菌效果难以达到商业化应用要求。1980年日本学者Kamihira等[2]用CO2对具有热敏性特征的生物制品、化合物、食品进行了杀菌实验，效果良好。国内直到20世纪90年代末才见文献提及并推荐将超临界CO2流体技术用于卫生、食品杀菌。超临界CO2使细胞致死的机理相对比较复杂，至今还没见文献作出较有说服力的阐述，大多是在相关推测与实验相结合的基础上提出的一些假设。目前普遍认为，其灭菌机理主要是以下几种[3]：1)超临界CO2处理能抽出微生物细胞内或细胞膜功能性物质，使微生物细胞受到损伤；2)由于进入细胞内CO2电离，使细胞质氢离子浓度增大，pH值下降；3)微生物细胞内某些酶由于浸透在CO2中而失活；4)溶解于微生物细胞内的CO2急速减压时体积膨胀而使细胞破裂。本实验主要研究超临界CO2处理后萃取液的主要成分，通过对不同时间段萃取液中的脂肪酸和氨基酸标志性成分的分析，追溯其来源，探讨超临界CO2杀菌过程中的萃取机制。由于软脂酸、硬脂酸等长链非极性脂肪酸是构成细菌生物膜的重要组成部分，而生物膜的破坏将导致细菌的死亡。丙氨酸、谷氨酸等极性较弱的小分子氨基酸是蛋白质的构件分子，氨基酸的缺失将使蛋白质合成受阻，最终导致细胞死亡。因此确定这两类物质为目标物质，用气相色谱-质谱(GC-MS)法确定目标脂肪酸的种类，用纸色谱法确定目标氨基酸的种类。

1 材料与方法

1.1 微生物菌种

大肠杆菌(Escherichia coli 20234)购于中国工业微生物菌种保藏中心。

1.2 材料与试剂

所用培养基及溶液所需试剂均为分析纯。

CM0002#液体培养基由中国工业微生物菌种保藏中心提供，配方为：蛋白胨质量分数0.5%、酵母膏质量分数0.3%、氯化钠质量分数0.5%，pH7.0，121℃下灭菌20min(CM0002#固体培养基：在液体培养基基础上添加质量分数为1.5%～2.0%的琼脂)。冷却后放置4℃下，备用。

磷酸盐缓冲液：Na2HPO40.1mol/L、NaH2PO40.1mol/L，pH7.0；纸色谱展开剂：正丁醇、醋酸、水按体积比4:1:2的比例在分液漏斗中混合，振荡后放置分层，弃去水层，取上层有机相，备用；纸色谱显色剂：质量分数为0.1%～0.25%茚三酮的水饱和正丁醇溶液。

1.3 仪器与设备

HA121-50-01-C超临界CO2萃取装置(萃取釜容积为1L，CO2由合肥恒泰电气技术有限公司提供，纯度99%)江苏南通华安超临界萃取有限公司；SWO-CJ-1F超净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；YXQ-SQ41.28蒸汽灭菌锅 上海华线医用核子仪器有限公司；SHY-2A恒温摇床 江苏金坛金城国胜实验仪器厂；YY0027-90电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂； R-201旋转蒸发仪 上海申胜生物技术有限公司；50μL微量进样器 上海富众仪器有限公司；QP2010气质联用仪 日本岛津公司；定性层析滤纸。

1.4 菌悬液的制备[4]

取CM0002#液体培养基100mL，无菌环境中用接种环刮取一环培养好的E.coil菌种到CM0002#液体培养基中，30℃摇床中培养16h。培养好的菌液在高速冷冻离心机中以6000r/min离心10min，用磷酸盐缓冲液清洗两次后倒入400mL无菌磷酸盐缓冲液中，此时菌悬液的浓度约为108CFU/mL，置于4℃冰箱中贮存。

1.5 活细胞数的检验

采用平板菌落计数法。将超临界CO2处理前后菌液稀释至一定浓度后，涂布于CM0002#固体培养基平板上，35℃下培养16h后计数[5]。

1.6 超临界CO2处理

为排除其他微生物和杂质对实验的干扰，实验前用75%乙醇对设备进行反复清洗，然后用无菌蒸馏水进行清洗。清洗结束后在萃取釜和分离釜分别取样，并涂布平板，计数，确保设备无菌。取200mL按1.4节所述方法制备的菌悬液加入萃取釜中，预先设定萃取压力20MPa，萃取温度40℃[6-8]。待萃取釜、分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ均达到设定的温度和压力时开始计时。分别收集30、60、90min萃取液，重复5次，同一时间段萃取液合并备用。

图1 高密度CO2灭菌设备工艺流程图Fig.1 Schematic diagram for supercritical carbon dioxide sterilization

1.7 萃取液成分分析

超临界CO2萃取液经过正己烷分层萃取后分离得到正己烷层和水层，分别旋转蒸发浓缩到1mL后对两部分混合物进行分析。

1.7.1 正己烷层成分GC-MS分析

正己烷层旋转蒸发后向蒸发瓶内剩余物加入5mL硫酸-甲醇，充分振荡溶解，55℃恒温水浴加热10min后加入5mL正己烷充分萃取，合并萃取液，用饱和NaCl溶液洗涤两次，静置去上清液保存备用。GC分析[9-10]：色谱条件为CPSil88(100m×0.25mm，0.20μm)；程序升温：初温70℃，保持10min，以5℃/min升温至170℃，保持20min，再以2℃/min升温至190℃，不保持，再以1℃/min升温至210℃，保持20min；进样口温度和检测器温度分别为250℃和260℃；载气为高纯氦(He)，流速0.84mL/min；进样量1.0μL，分流比为50:1；质谱条件：电离方式为电子轰击(EI)，电子能量70eV，接口温度260℃，电子倍增器电压1.89kV，扫描范围35～500u。

1.7.2 水层成分分析[9,11]

裁取30cm长5cm宽的中速定性层析滤纸，使用微量进样器吸取50μL水层萃取液，在距离滤纸底端约5cm处加样，一个样品多次点样，中间用电吹风吹干。在密闭的展开容器中展开，展开剂渗透到离滤纸顶端约5cm处取出，自然干燥，喷显色剂加热显色。计算Rf值。

式中：R为各物质斑点中心离开原点的距离；R0为

溶剂渗透前沿离开原点的距离。

2 结果与分析

2.1 正己烷层成分GC分析[12]

对超临界CO2处理30min后的萃取液进行GC-MS分析[12-13]，得到气相色谱图(图2)。通过与长链脂肪酸和相应十九烷酸甲酯标准品保留时间的对照，将所得质谱图与质谱数据库中的标准谱图进行对照，确定其脂肪酸的种类有：峰1为软脂酸甲酯；峰2为硬脂酸甲酯；峰3为油酸甲酯；峰A为加入的内标物十九烷酸甲酯。

图2 超临界CO2处理30min萃取液气相色谱图Fig.2 Gas chromatogram of Escherichia coli suspension after supercritical carbon dioxide sterilization for 30 min

对超临界CO2处理60min后的萃取液进行GC-MS分析[14-15]，得到的气相色谱图如图3所示。同法确定其脂肪酸的种类有：峰1为软脂酸甲酯；峰2为硬脂酸甲酯；峰3为油酸甲酯；峰4为亚油酸甲酯。

图3 超临界CO2处理60min萃取液气相色谱图Fig.3 Gas chromatogram of Escherichia coli suspension after supercritical carbon dioxide sterilization for 60 min

对超临界CO2处理90min后的萃取液进行GC-MS分析，得到的气相色谱图如图4所示。同法确定其脂肪酸的种类有：峰1为软脂酸甲酯；峰2为硬脂酸甲酯；峰3为油酸甲酯；峰4为亚油酸甲酯；峰5和峰7为亚麻酸甲酯峰(双键位置不同，出峰时间不同)；峰6为二十二碳六烯酸甲酯(二十二碳六烯酸DHA)；峰8为花生四烯酸甲酯；峰9和峰10为桐油酸甲酯。

通过3个时间段萃取液出峰时间的比对可以发现：随着超临界萃取时间的增加，萃取液中被萃取物质的种类不断增多，而且萃取液中含有硬脂酸、软脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、桐油酸、花生四烯酸及DHA。这些物质主要来自大肠杆菌细胞上的磷脂类物质，在超临界CO2处理下被萃取出来。

图4 超临界CO2处理90min萃取液气相色谱图Fig.4 Gas chromatogram of Escherichia coli suspension after supercritical carbon dioxide sterilization for 90 min

图5 空白对照气相色谱图Fig.5 Gas chromatogram of blank control smaple

空白对照组(不经超临界CO2处理的菌悬液)在以上各时间段均不出峰(图5)，而通过对不同时间段萃取物的GC-MS分析，可以发现在超临界CO2处理过程中大肠杆菌细胞中的脂肪酸类物质被萃取出来，而且对于不同时间段被萃取出物质的种类有所差别。

2.2 水层萃取物纸层析

层析滤纸上出现紫色斑点，说明萃取液中可能含有氨基酸、蛋白质和多肽类物质，而双缩脲反应没有紫色出现，证实溶液中没有蛋白质和多肽类物质的存在，因此可以断定溶液中只存在氨基酸类物质[16-17]。不同时间段的超临界萃取液纸层析结果如表1～3所示。

表1 超临界CO2处理30min萃取液纸层析Table 1 Paper chromatographic results of Escherichia coli suspension after supercritical carbon dioxide sterilization for 30 min

表2 超临界CO2处理60min萃取液纸层析Table 2 Paper chromatographic results of Escherichia coli suspension after supercritical carbon dioxide sterilization for 60 min

分析纸层析的结果发现，3个不同时间段萃取液在层析滤纸上都出现了两个较为明显的斑点，通过计算得到各点处的Rf。查表氨基酸的Rf值和最小检知量，发现其中谷氨酸和甘氨酸的Rf值为0.32，丙氨酸的Rf值为0.39(谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸标准品纸层析结果得到的Rf值与查表得到的结果相同)，这3种氨基酸与计算得到的滤纸上氨基酸的Rf值较为接近。因此，滤纸上的氨基酸可能为这3种氨基酸中的两种或3种。它们必然来自于大肠杆菌细胞，可能是细胞中游离的氨基酸，或者是细胞壁、细胞膜上蛋白质组分水解而产生的氨基酸。

3 结 论

通过对超临界CO2处理后不同时间段大肠杆菌萃取液中脂肪酸类和氨基酸类物质成分的分析，可以判定：超临界CO2杀菌过程中发生了萃取作用。长链脂肪酸类物质及一部分极性较弱的小分子氨基酸被萃取出来，并且随着萃取时间的增加被萃取出的脂肪酸的种类也随之增加。

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表3 超临界CO2处理90min萃取液纸层析Table 3 Paper chromatographic results of Escherichia coli suspension after supercritical carbon dioxide sterilization for 90 min

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Extraction Mechanism during the Sterilization of Supercritical Carbon Dioxide

ZHOU Xian-han1,2，CHENG Li-mei2，ZENG Qing-mei1，ZHANG An2，SONG Jun-hua2，ZHOU Dian-fei2
(1.Engineering Research Center of Bio-process, Ministry of Education, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China；2.School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Functional components in cytoplasm, cell membrane and cell wall can be dissolved by supercritical carbon dioxide. As a result, the cells will be damaged and die due to inactivation. The extraction mechanism during supercritical carbon dioxide sterilization was explored in this study. An Escherichia coli suspension at a concentration of 108CFU/mL was prepared and treated with supercritical carbon dioxide and composition analysis was performed on the extracts obtained at different time points. The results indicated that both non-polar fatty acids and polar weak small amino acids were the functional components in cells. This investigation demonstrates that extraction indeed occurs during supercritical carbon dioxide sterilization.

supercritical carbon dioxide；extraction；sterilization mechanism；Escherichia coli

TS201.3

A

1002-6630(2010)17-0014-04

2009-11-05

国家自然科学基金项目(30871739；30571304)；安微省教育厅重点科研项目(KJ2007A099)

周先汉(1959—)，男，副教授，研究方向为农产品深加工、食品安全。E-mail：zhxhan@163.com