李艳琴，周凤超，陕 方，边俊生，王耀文，夏 楠

(1.山西大学生物技术研究所，化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西 太原 030006；2.山西省农业科学院农产品综合利用研究所，山西 太原 030006)

荞麦麸皮提取物对α-葡萄糖苷酶活性的影响

李艳琴1，周凤超1，陕 方2，边俊生2，王耀文1，夏 楠1

(1.山西大学生物技术研究所，化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西 太原 030006；2.山西省农业科学院农产品综合利用研究所，山西 太原 030006)

本实验分别用乙醇和水从荞麦麸皮中提取到了以荞麦黄酮为主要成分的乙醇粗提物和以荞麦糖醇为主要成分的水粗提物，并将乙醇粗提物经高压水解，获得乙醇粗提物的水解物。研究这3种提取物对α-葡萄糖苷酶活性的影响，并以阿卡波糖和D-手性肌醇为参照。比色法和液相色谱法测得，苦荞麸皮乙醇粗提物的主要成分为苦荞黄酮，黄酮含量为74.0%，其中86.5%为芦丁，槲皮素和异槲皮素微量；乙醇粗提物经高压水解后，总黄酮含量为76.2%，其中，芦丁、槲皮素和异槲皮素分别占60.6%、25.2%、13.5%。甜荞麸皮水粗提物的主要成分为D-手性肌醇、肌醇，其含量分别为43.6%、2.9%。3种荞麦麸皮提取物均具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性，作用强度分别为：乙醇粗提物的水解物＞乙醇粗提物＞水粗提物， IC50分别为0.0085、0.0578、17.3551g/L。苦荞黄酮经高压水解后，抑制α-葡萄糖苷酶活性显著提高，与阿卡波糖IC50(0.0335g/L)相比，约是它的1/4；水粗提物在低质量浓度下抑制效果不明显，在较高的质量浓度下则表现出抑制活性。

荞麦提取物；α-葡萄糖苷酶；抑制剂；糖尿病

荞麦是一种药食同源的蓼科(Polygobaceae)作物，含有多种降糖、降脂、降血压等药用成分，是一种值得加快开发利用的功能食品[1-2]。苦荞(Fagopyrum tataricum(L.)Gaertn)和甜荞(Fagopyrum esculentum

Moench)分别是荞麦属的两个栽培种。苦荞麸皮中含有大量的黄酮类化合物，它是一类α-葡萄糖苷酶抑制剂，能有效预防糖尿病发生、降低血糖水平[3-4]、减缓糖尿病的发展和减轻糖尿病并发症[5-7]。甜荞麸皮中糖醇类物质丰富，可在人体肠道微生物的作用下降解为D-手性肌醇，提高胰岛素受体敏感性、改善胰岛素抵抗，从而降低人体中的血脂、血糖[8]。

α-葡萄糖苷酶位于小肠刷状细胞表面，是水解多糖为单糖的关键酶[9]，因此α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物能通过降低α-葡萄糖苷酶的活性、调节餐后胃肠激素[10-11]而有效控制餐后血糖的升高。目前市场上较为常见的此类药物为拜耳公司的阿卡波糖(拜糖平)。近年来，糖尿病的患病率急剧上升。有关专家预测，2025年全球糖尿病患者可达3亿[12]。因此，开发预防糖尿病发生的功能食品和高效、无毒副作用的降糖药物，具有广泛的应用前景。

本实验测定荞麦麸皮提取物的主要成分，研究它们对α-葡萄糖苷酶的抑制能力，并与拜糖平片进行比较，筛选功效较高的药物成分。旨在为发展荞麦的深加工技术，促进糖尿病药物的开发与应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

荞麦麸皮粗提物及其水解物由山西省农业科学院农产品综合利用研究所提供。

α-葡萄糖苷酶、D-手性肌醇 美国Sigma公司；pNP-α-Glu(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranosodide) 中国上海Seebio公司；还原性谷胱甘肽(L-Glutathione reduced) 中国北京Solarbio公司；拜糖平(Glucobay，每片含阿卡波糖50mg) 德国拜耳公司。实验用水为超纯水。

日立U-2010紫外差谱仪 日本Hitachi Instruments公司；720型 Inolab pH计 德国WTW公司； 9005型水浴锅 美国PolyScience公司；1525型高效液相色谱仪 美国Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 α-葡萄糖苷酶活性的测定

阿卡波糖存储液：取拜糖平1片，溶于超纯水中，定容于10mL容量瓶中，超滤膜过滤，阿卡波糖质量浓度为5g/L。

α-葡萄糖苷酶活性的测定：采用1mL反应体系；将浓度为4×10-3mol/L 的75μL底物pNPG(用pH 6.8的0.1mol/L磷酸钾缓冲液配制)、浓度为3.25×10-3mol/L的25μL还原性谷胱甘肽(用pH 6.8的0.1mol/L磷酸钾缓冲液配制)、一定量的抑制剂(提取物存储液或阿卡波糖存储液)依次加入到10mL小试管中，用缓冲液补加至900 μL。于37℃水浴10min，然后迅速加入浓度为1.06×10-6mol/L的100μL α-葡萄糖苷酶溶液(用pH 6.8的0.1mol/L磷酸钾缓冲液配制)，37℃水浴，精确计时10min，期间不断摇晃。计时完毕，迅速加入0.1mol/L的Na2CO3溶液5mL以终止反应，而后扫描并记录A410nm值，以蒸馏水代替酶液为空白对照。

式中：AE为不加抑制剂的吸光度；AI为加入抑制剂的吸光度。

1.2.2 荞麦麸皮粗提物主要成分及含量测定

总黄酮含量测定采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[13]；芦丁、槲皮素和异槲皮素含量测定采用HPLC法[14]；糖醇含量测定采用HPLC法[15]。

2 结果与分析

2.1 苦荞麸皮乙醇粗提物和水解物的主要成分及含量

比色法、高效液相色谱法测得苦荞麸皮乙醇粗提物的主要成分为苦荞黄酮，总黄酮含量为74.0%，其中86.5%是芦丁，槲皮素和异槲皮素微量；乙醇粗提物经2.0MPa高压水解后，总黄酮含量为76.2%，其中，芦丁、槲皮素和异槲皮素分别占60.6%、25.2%、13.5%。

2.2 甜荞麸皮水粗提物的主要成分及含量

高效液相色谱法测得甜荞麸皮水粗提物的主要成分为D-手性肌醇、肌醇，其含量分别为43.6%、2.9%。

2.3 α-葡萄糖苷酶酶促反应条件的确定

2.3.1 反应时间的确定

在酶促反应中，酶活力用单位时间内酶催化反应所得的产物浓度即反应速度来表示。在反应的初期，产物浓度与反应时间成正比的线性关系，这个阶段测定的酶活力最准确；随着反应时间的延长，底物浓度的降低、产物浓度的升高等各种因素干扰了酶促反应，所以，酶活力测定应以反应的初速度表示。本实验中，产物在波长410nm处的吸光度与产物浓度成正比，因而以A410nm值与反应时间作图，确定酶活力测定的反应时间，结果见图1。

图1 反应时间与反应速度的关系Fig.1 Relationship between reaction time and reaction rate

从图1可以看出，在反应10min之内，产物浓度与反应时间为线性关系。因此，后续的实验中，以10min为酶活力测定反应时间。

2.3.2 底物浓度的确定

酶促反应体系中，底物浓度影响酶促反应速度是一个复杂的过程。当底物浓度较低时，反应速度与底物浓度的关系成正比，随着底物浓度的增加，反应速度趋向一个极限，即反应速度达到最大值，这时酶被过量的底物所饱和，即底物浓度不再影响反应速度的测定。本实验分别以1×10-5、2×10-5、4×10-5、6× 10-5、 8×10-5mol/L为底物浓度，测定反应体系的A410nm值，并计算反应速度，以反应速度(V)对底物浓度([S])作图，确定酶活力测定的底物浓度，结果见图2。

图2 底物浓度与反应速度的关系Fig.2 Relationship between substrate concentration and reaction rate

从图2可以看出，底物浓度小于6×10-5mol/L时，反应速度随着底物浓度的增加而增大，当底物浓度为6×10-5mol/L时，反应速度达到最大值，之后，底物浓度继续增加，反应速度趋于不变，说明这时底物已经过量。依据参考文献[16-17]该方法的底物浓度范围，在后续实验中选择3×10-4mol/L的底物浓度，以此保证在整个酶促反应过程中有足够的底物饱和酶。

2.4 荞麦麸皮提取物对α-葡萄糖苷酶活性的影响

1mL反应体系中，底物浓度为3×10-4mol/L，还原性谷胱甘肽浓度为8.125×10-5mol/L，酶浓度为1.06×10-7mol/L；加入不同浓度荞麦麸皮粗提物，测其对α-葡萄糖苷酶活性的影响，结果见图3、4。

由图3、4可见，无论是乙醇粗提物还是水粗提物，均有抑制α-葡萄糖苷酶的能力；作用强度分别为：苦荞麸皮乙醇粗提物的水解物＞苦荞麸皮乙醇粗提物＞甜荞麸皮水粗提物；半数抑制浓度(IC50)分别为0.0085、0.0578、17.3551g/L。苦荞黄酮经水解后，抑制α-葡萄糖苷酶活性显著提高，比市售α-葡萄糖苷酶抑制剂(阿卡波糖)的抑制活性还强，水解物的IC50约是阿卡波糖IC50(0.0335g/L)的1/4。甜荞麸皮水粗提物在低质量浓度下抑制效果不明显，在较高的质量浓度(高于14g/L)下则表现出抑制活性，而纯品D-手性肌醇抑制α-葡萄糖苷酶的活性非常低，其IC50为59.0612g/L。这一结果表明甜荞麸皮水粗提物中抑制α-葡萄糖苷酶活性的主要成分不是D-手性肌醇。

图3 苦荞麸皮乙醇粗提物、乙醇粗提物的水解物和阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶活性的比较Fig.3 Inhibition effects of the ethanol extract and its hydrolysate as well as acarbose onα-glucosidase activity

图4 甜荞麸皮水粗提物、D-手性肌醇抑制α-葡萄糖苷酶活性的比较Fig.4 Inhibition effects of the water extract and D-chiro-inositol on α-glucosidase activity

3 讨 论

麸皮是面粉制作过程中的副产品，一般作为饲料利用，然而，麸皮中含有的各种活性成分远高于心粉中的含量[18]。本研究以荞麦麸皮为原料，提取有效成分，研究其功能和作用机理。苦荞、甜荞分别是荞麦属的两个栽培种，苦荞麸皮中含有大量的黄酮类物质，甜荞麸皮中富含糖醇，黄酮类物质溶于60%的乙醇，糖醇类物质溶于水。本实验选择苦荞乙醇粗提物和甜荞水粗提物为研究对象，对其具有降低血糖作用的机理进行了研究。

黄酮是一类α-葡萄糖苷酶抑制剂，食用荞麦能降低餐后血糖，作用途径之一是通过荞麦黄酮抑制α-葡萄糖苷酶的活性来实现的，本实验的研究结果也证明了这一点。苦荞麸皮乙醇粗提物经高压水解后，将一部分芦丁转化为槲皮素和异槲皮素，其抑制活性大大提高，这一结果是否与一部分芦丁水解为槲皮素和异槲皮

素有关？为此，笔者研究了芦丁、槲皮素和异槲皮素与α-葡萄糖苷酶的作用，结果证明槲皮素抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力远高于芦丁[19]。

D-手性肌醇是胰岛素信号传导过程中重要的中介物质，能够提高胰岛素受体敏感性，改善胰岛素抵抗，激活糖原合成酶和丙酮酸脱氢酶(PDH)，降低血糖水平[20-21]。本实验中甜荞水粗提物在低质量浓度下抑制α-葡萄糖苷酶效果不明显，在较高的质量浓度下表现出抑制活性；而D-手性肌醇纯品与α-葡萄糖苷酶的作用很弱，这些均说明甜荞麸皮水粗提物中与α-葡萄糖苷酶作用的物质不是D-手性肌醇，而是其他水溶性的物质。

综上所述，苦荞麸皮乙醇粗提物经高压水解后抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力远高于目前市场化的高端降糖药物拜糖平，有望开发出一种高效、无毒副作用、成本低廉的α-葡萄糖苷酶抑制剂类降糖药物，或作为一种食品添加剂用于糖尿病人的专用食品中。荞麦麸皮中其他物质的成分和降糖途径，例如水粗提物中的成分和降糖机理还有待进一步研究。

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Effects of Different Solvent Extracts from Buckwheat Bran on α-Glucosidase Activity

LI Yan-qin1，ZHOU Feng-chao1，SHAN Fang2，BIAN Jun-sheng2，WANG Yao-wen1，XIA Nan1
(1.Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering, Ministry of Education, Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；2.Institute of Comprehensive Utilization of Agricultural Products, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030006, China)

The respective effects of buckwheat bran ethanol extract mainly composed of flavonoids and its high-pressure hydrolysate as well as the water extract from the material mainly composed of fagopyritols onα-glucosidase activity were measured using acarbose or D-chiro-inositol as a

ubstance. The major components of the ethanol extract were flavonoids, with a total content of 74.0%, in which the relative content of rutin was 86.5% and those of quercetin and isoquercetin were at trace levels according to colorimetric and HPLC determinations. However, after high-pressure hydrolysis, the content of total flavonoids in the ethanol extract increased to 76.2%, of which rutin, quercetin and isoquercetin represented 60.6%, 25.2% and 13.5%, respectively. The major components of the water extract were 43.6% D-chiro-inositol and 2.9% inositol. All the three tested samples had inhibition effect onα-glucosidase in the following decreasing order: the hydrolysate of the ethanol extract ＞the ethanol extract ＞ the water extract. Their IC50 values were 0.0085, 0.0578 g/L and 17.3551 g/L, respectively. Therefore, highpressure hydrolysis could increase the inhibition effect of buckwheat bran ethanol extract onα-glucosidase activity (the IC50 of the hydrolysate was approximately one quarter of that of acarbose; the smaller IC50, the stronger inhibition effect). In addition, the water extract did not inhibit the activity of the enzyme at low concentrations, but had inhibition effect at high concentrations.

buckwheat extract；α-glucosidase；inhibitor；diabetes

Q946.8

A

1002-6630(2010)17-0010-04

2010-04-26

国家自然科学基金项目(30771310)；“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAD02B06)

李艳琴(1960—)，女，副教授，研究方向为植物分子生物学和植物功能成分。E-mail：yanqin@sxu.edu.cn