郑　洲　缪锦来

摘要光镊拉曼光谱技术（LTRS）是将光学囚禁技术与显微拉曼光谱技术相结合，用同一束光来实现囚禁单个悬浮细胞并激发细胞分子的拉曼光谱。利用LTRS系统，可以实现对单个南极石油烃降解嗜冷菌细胞内的生化代谢过程的实时监测，了解其参与石油烃分解代谢的过程，获知单个细胞内部生化分子变化与环境变化的相互关系，更好的了解其降解机制。

关键词光镊拉曼光谱技术；南极细菌；石油烃；低温降解

中图分类号X55文献标识码A文章编号 1007-5739（2009）04-0263-02

1光镊拉曼光谱技术特点

激光拉曼光谱法被公认为是研究生物大分子结构、动力学和功能的有效方法，是生命科学研究领域很有应用潜力的工具。从拉曼光谱特征峰的位置、强度和线宽可以获得样品的分子组成及结构信息，拉曼光谱已成为研究物质分子结构的有效手段。共焦显微拉曼光谱技术可以研究单个细胞甚至细胞器，但由于人为的用物理或化学手段固定研究对象，细胞周围的环境发生改变，甚至细胞死亡，对细胞的生理带来了未知的影响。最近，光镊拉曼光谱技术（laser-tweezers-Raman-spectroscopy，LTRS）的出现，使人们可以在接近自然的生理状态下研究单个悬浮细胞或细胞器[1，2]。LTRS是将光学囚禁技术与显微拉曼光谱技术相结合，用同一束光来实现囚禁单个悬浮细胞并激发细胞分子的拉曼光谱，其原理是利用高度汇聚的激光束产生的梯度力囚禁溶液中的活细胞，使之固定在激光微束中，再通过瞬时增强的光束来激发细胞内分子的拉曼光谱，从而实时获得该细胞的拉曼光谱及其生化性质。由于细胞被囚禁在光束焦点位置，共焦光路优化了散射光的收集，从而可获得高灵敏度。选用适当的激光波长、功率和激发时间，激光束不会伤害细胞，被囚禁的细胞依然悬浮在不受干扰的环境中，得到的是接近自然生理状态的单个活细胞的拉曼光谱。

2LTRS在单细胞中的应用情况

光镊拉曼光谱技术可以在接近自然的生理状态下研究单个细胞或细胞器，探索接近生理状态下的单细胞生命活动，可以无损地提供丰富的分子结构和物质成分的信息，是一种很有应用潜力的工具，正在生命科学研究领域广泛应用。目前，光镊拉曼光谱技术已用于研究溶液中单个活体的红细胞、细菌和酵母等，得到不同细胞的高质量的拉曼光谱，使得研究溶液中的单个活细胞的生化性质成为可能。Tang等[2]利用光镊拉曼光谱技术研究了火炬松转基因细胞系的单细胞拉曼光谱特征。LTRS系统可以成为区别癌细胞与正常细胞的有效手段。杨文沛等[3]利用LTRS系统测量了单个肝癌细胞的拉曼光谱，并利用多元统计分析方法对光谱进行分析，从而建立一个识别正常细胞和癌细胞的数学模型，表征了单个肝癌细胞与正常细胞的差异。岳粮跃等[4]利用LTRS系统对红细胞冻存前后的变化，以及对红细胞被解冻后在不同溶液中的变化情况进行了拉曼光谱研究。王桂文等[5]研究表明，LTRS 系统可以研究单个血小板细胞的拉曼光谱，并可以区分不同物种的血小板，是研究溶液中接近自然生理状态下小生物体、细胞的有力工具，为进一步研究血小板的生理生化反应提供了良好的实验基础。王桂文等[6]采用LTRS系统，在水溶液中直接俘获单个伴孢晶体，并收集其拉曼光谱信号，得到群体伴孢晶体的分子结构和群体内各晶体蛋白之间的信息。该方法免去了复杂的纯化过程，为Bt伴孢晶体蛋白的研究提供了一种快速简便、可以洞悉群体内单个晶体蛋白结构差异的手段。王桂文等[7]利用LTRS系统观察活性干酵母单细胞活化过程，记录了干酵母单细胞的生长现象，既可实时观察单个细胞活化过程的光谱变化，又可获知细胞间的差异。

3LTRS在南极细菌低温降解石油烃中的应用

极地石油污染已成为一个普遍而严重的问题。在最近十几年里，人类在极地的活动日益频繁，大量的柴油、润滑油和原油进入海水中，人为给极地海洋造成了烃污染，石油烃已经成为极地海洋生态系统中的主要污染物。由于极地海洋常年处于低温状态，短链石油烃蒸发缓慢，长链烃凝为固体，使有机污染物持久存在，对当地生物资源及生态环境的危害很大。因此，对低温环境下石油烃降解的研究十分重要，而生物降解以其高效、安全日益受到人们的重视。

微生物群落对石油烃的生物降解是清除污染物的一个主要机制。南极嗜冷菌在低温海洋环境中可以高效降解石油，当南极生态系统被石油烃污染后，能降解石油烃的土著微生物便开始迅速生长，以适应被污染的环境[8]。环境因素和生物因素决定了石油烃生物降解的速率和程度。在极地海洋生态系统中，石油烃的降解涉及到的主要环境因素是温度。温度影响石油烃的物理性质和化学组分、微生物的代谢速率和微生物群落组成，间接对烃的降解速率产生影响，研究表明南极细菌在20℃对石油烃的降解率高于4℃。然而，低温时细菌对石油烃的降解虽然缓慢，但是经过一段时间后，降解率与常温下并无区别，这表明低温仅仅延迟了降解时间，并不影响最终的降解率[9]。迄今，已发现的南极烷烃低温降解菌较少，对其研究也均以菌株的鉴定、催化反应和降解组分分析为主[10]。对烷烃低温降解过程中南极菌单个细胞的内部生化分子变化及其参与烷烃代谢的机制还不清楚，这些基本问题都亟需研究。

拉曼光谱为获知单个细胞内部生化分子变化与环境变化的相互关系提供了有力的工具，从拉曼光谱的特征峰的位置、强度和线宽可以获得样品的分子组成及结构信息。近年来，已有学者用拉曼光谱技术对南极微生物细胞的实地生命活命活动进行研究，鉴定了一些化合物，并探明其在微生物适应南极极端环境中的作用和机制[11]，这些对南极微生物细胞生命活动的认识通常都是通过研究其群体样品而得到的统计平均信息，不能探索接近生理状态下的单细胞生命活动。而LTRS技术可以在接近其自然的生理状态下研究单个细胞或细胞器，可以实时观察单个细胞或细胞器的生物化学过程，或判别不同类型、不同状态的细胞，获知很多掩盖在群体平均信息下的个体生命信息。细胞处于溶液中，其生理活性不受影响，可以实现长时间对同一个细胞进行监测。将LTRS技术应用于石油烃微生物低温降解的研究，可以了解石油烃低温降解过程中单个南极细菌细胞如何协调能量、细胞生长与烷烃降解三者的关系，从单个细胞水平获得对南极细菌低温降解石油烃的新认识，获知单个细胞内部生化分子变化与环境变化的相互关系；可以实时监测单个南极细菌细胞低温降解石油烃的动态过程，并可以结合光镊进行细胞分选；还可以同时记录石油烃低温降解过程胞内、胞外的实时石油烃浓度，这是其他方法无法实现的。因此，应用单细胞激光镊子拉曼光谱技术研究石油烃微生物的低温降解，可以更好的了解其降解机制，这对低温海洋环境中石油污染物的消除和环境修复具有重要意义。

4参考文献

[1] XIE CA，Li Y Q，TANG W，et al. Study of dynamical process of heat denaturation in optically trapped single microorganisms by near-infrared Raman spectroscopy[J].Journal of Applied Physics，2003（94）：6138-6142.

[2] TANG W，NEWTON RJ，XIE CA，et al. Non-destructive analysis of the nuclei of transgenic living cells using laser tweezers and near-infrared raman spectroscopic technique[J].Genomics Proteomics Bioinformatics，2005，3（3）：169-178.

[3] 杨文沛，姚辉璐，朱淼，等.单个肝癌细胞的拉曼光谱分析研究[J]. 激光与红外，2007，37（9）：824–827.

[4] 岳粮跃，王桂文，姚辉璐，等.光镊捕获的单个解冻人血红细胞的拉曼光谱研究[J].生物物理学报，2007，23（1）：75–80.

[5] 王桂文，姚辉璐，何碧娟，等.单个血小板的拉曼光谱分析[J].光谱学与光谱分析，2007，27（7）：1347–1350.

[6] 王桂文，姚辉璐，彭立新，等.拉曼镊子分析单个苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白[J].分析化学，2007，35（9）：1351-1354.

[7] 王桂文，姚辉璐，彭立新，等.一种酵母细胞生长现象的实时单细胞拉曼光谱观察[J].微生物学通报，2007，34（6）：1109-1113.

[8] DELILLE D，DELILLE BE. Effectiveness of bioremedaiation of crude oil contaminated subantarctic intertidal sediments：the microbial response[J].Microb Ecol，2002（44）：118-126.

[9] BRAKSTAD OG，KRISTIN B. Biodegradation of petroleum hydro-carbons in seawater at low temperatures（0-5℃）and bacterial commun-ities associated with degradation[J].Biodegradation，2006（17）：71-82.

[10] MARIA DD，ANGELINA LG，MICHAUD L，et al.Diesel oil and PCB-degrading psychrotrophic bacteria isolated from Antarctic seawaters（Terra Nova Bay，Ross Sea）[J].Polar Research，2005，23（2）：141-146.

[11] VILLAR SE，EDWARDS HG，COCKEL L. Raman spectroscopy of endoliths from Antarctic cold desert environments[J].Analyst，2005，130（2）：156-162.